一种提高光滑球拟酵母抵御高渗透压胁迫的方法技术

一种提高光滑球拟酵母（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ　ｇｌａｂｒａｔａ）抵御高渗透压胁迫的方法，属于代谢控制策略优化发酵过程技术领域。本发明专利技术采用将来源于乳酸乳球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ）中编码形成水的ＮＡＤＨ氧化酶ｎｏｘ基因过量表达于丙酮酸工业生产菌株Ｔ．ｇｌａｂｒａｔａ中，获得了一株ＮＡＤＨ氧化酶活性为３４．８Ｕ.ｍｇ↑［－１］　ｐｒｏｔｅｉｎ的重组菌Ｔ．ｇｌａｂｒａｔａ　ＰＤｎｏｘＥ。在Ｔ．ｇｌａｂｒａｔａ中表达ｎｏｘ基因，显著降低了ＮＡＤＨ／ＮＡＤ↑［＋］的比例，提高了与水形成途径相关的酶活，使胞内的含水量升高。在高渗条件下（３８２４ｍＯｓｍｏｌ.ｋｇ↑［－１］）Ｔ．ｇｌａｂｒａｔａ　ＰＤｎｏｘＥ的菌体生长明显提高。结果表明可以通过控制水的生成途径提高酵母细胞渗透适应性。

【技术实现步骤摘要】

一种提高光滑球拟酵母(7^/0戸& g/Wrato)抵御高渗透压胁迫的方法，属于代谢控制策略优化发酵过程
本专利技术涉及一种在r g/Wrato内过量表达来源于L /ac^中编码形成水的NADH氧化酶wox基因。提高了与水形成途径相关的酶活，使胞内的水含量升高，保护细胞在高渗条件下的生长和功能。
技术介绍
NADH氧化酶直接将NADH氧化成NAD+并将02还原成H20。研究结果表明这个酶的表达会导致NADH/NAD+的比例急剧下降，并显著的提高细胞对抗氧胁迫的能力。另外，NADH可以将02直接还原成水，不需要经过电子传递链，提高了形成水的效率，增加了胞内水含量，增强了细胞在高渗条件下的生长和功能。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种通过在光滑球拟酵母r g/6mto表达形成水的NADH氧化酶，显著降低了 NADH/NAD+的比例，提高了与水形成途径相关的酶活，使胞内水含量升高。在高渗条件下(3824mOsmobkg—i)r.g/a6ratoPD/wxE的菌体生长明显提高。本专利技术的技术方案 ，利用多重维生素营养缺陷型的丙酮酸工业生产菌株光滑球拟酵母(7:g/Wrato)CCTCC M202019为模式菌株，采用将来源于乳酸乳球菌(Z^ctococcws/acto)中编码形成水的NADH氧化酶ox基因过量表达于CCTCC M202019中，获得了一株NADH氧化酶活性为34.8 l>mg protein的重组菌7: g/WratoPDwojcE，在7: g/Wrato中表达ox基因，显著降低了 NADH/NAD+的比例，提高了与水形成途径相关的酶活，使胞内的含水量升高，在3824mOsmoHcg高渗条件下r. g/6ratoPDo^E的菌体生长明显提高，表明通过控制水的生成途径提高酵母细胞渗透适应性，通过过量表达NADH氧化酶，保护光滑球拟酵母(rora/o戸^y g/a6rato)抵御高渗透压胁迫。1、菌株原菌(模式菌株)光滑球拟酵母(7:g/a6rato)CCTCCM202019，烟酸(NA)、生物素(Bio)、硫胺素(Bi)、吡哆醇(Pdx)四种维生素营养缺陷型，且丙酮酸脱羧酶活性组成型降低，为江南大学选育菌株，该菌种已申请中国专利，申请号为02113142.2，公开号为CN1392246A。工程菌在光滑球拟酵母(7:g/Wrato) CCTCCM 202019细胞内过量表达来源于乳酸乳球菌(丄aococc^ /ac&)中编码形成水的NADH氧化酶ox基因，构建工程菌r g/a6rato PDojcE。2、 培养基种子和斜面培养基(g'L):葡萄糖30，蛋白胨10， KH2P04 1， MgS04'7H200.5;琼脂20 (斜面培养基)，pH5.5。基本发酵培养基(L):葡萄糖100g， NH4S04 7g， MgS04'7H20 0.8g， KH2P045g， CH3COONa5g， pH5.0。3、 摇瓶培养将3CTC、 200rpm下培养24h的种子以10%的接种量分别转入基本发酵培养基，于3(TC、 200rpm条件下培养48h，按实验要求添加不同浓度的烟酸、维生素B!、维生素Bs、生物素Bio。细胞千重的测定取一定量的菌悬液置于10 mL容量瓶中，加2 mL盐酸溶解菌悬液中的碳酸钙，加入去离子水定容至10 mL，摇匀，用UV 7500型可见分光光度计，于660nm处比色测OD值，用细胞干重标准曲线算得细胞干重。本专利技术的有益效果原菌和工程菌在渗透压升高到2947 mOsmol'kg时菌体量都有明显下降。然而，在高渗条件下，工程菌r.g/6ratoPDwoxE在发酵终点的菌体量高于原菌，分别提高17.5°/。 (2018 mOsmol'kg'1) ， 33.2% (2947mOsmol'kg)和71.80/0 (3824 mOsmol.kg)。具体实施方式实施例1:在光滑球拟酵母？: 细胞内过量表达来源于乳酸乳球菌中编码形成水的NADH氧化酶m x基因，构建工程菌T g/a6rato PDmojcE。发酵48 h，在渗透压分别为2018 mOsmol'kg， 2947 mOsmol'kg_1和3824 mOsmol'kg-1的条件下，最终菌体浓度分别为7.2 g丄'1， 5.8 g丄'1， 2.3 g丄—1，相比对照分别提高18.0 % (2018mOsmol.kg)， 34.9 % (2947 mOsmol.kg)和76.9 % (3824 mOsmol'kg-1)。对照实施例本专利技术所用的菌种光滑球拟酵母73 g/^)rato，先转斜面在3(TC培养箱中培养12h，然后挑取单菌落用种子培养基培养24h，最后摇瓶发酵48h，温度30°C，转速200rpm。渗透压分别为2018 mOsmol'kg， 2947 mOsmol'kg和3824mOsmol'kg-1，最终菌体浓度分别是6.1 g丄(2018 mOsmol'kg-1), 4.3 g丄(2947mOsmol.kg)和1.3 g七-1 (3824 mOsmol'kg-1^4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高光滑球拟酵母抵御高渗透压胁迫的方法，其特征是利用多重维生素营养缺陷型的丙酮酸工业生产菌株光滑球拟酵母（Ｔ．ｇｌａｂｒａｔａ）ＣＣＴＣＣＭ２０２０１９为模式菌株，采用将来源于乳酸乳球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ）中编码形成水的ＮＡＤＨ氧化酶ｎｏｘ基因过量表达于ＣＣＴＣＣ　Ｍ２０２０１９中，获得了一株ＮＡＤＨ氧化酶活性为３４．８Ｕ.ｍｇ↑［－１］　ｐｒｏｔｅｉｎ的重组菌Ｔ．ｇｌａｂｒａｔａ　ＰＤｎｏｘＥ，在Ｔ．ｇｌａｂｒａｔａ中表达ｎｏｘ基因，显著降低了ＮＡＤＨ／ＮＡＤ＋的比例，提高了与水形成途径相关的酶活，使胞内的含水量升高，在３８２４ｍＯｓｍｏｌ.ｋｇ↑［－１］高渗条件下Ｔ．ｇｌａｂｒａｔａ　ＰＤｎｏｘＥ的菌体生长明显提高，表明通过控制水的生成途径提高酵母细胞渗透适应性，通过过量表达ＮＡＤＨ氧化酶，保护光滑球拟酵母（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ　ｇｌａｂｒａｔａ）抵御高渗透压胁迫。

【技术特征摘要】
1、一种提高光滑球拟酵母抵御高渗透压胁迫的方法，其特征是利用多重维生素营养缺陷型的丙酮酸工业生产菌株光滑球拟酵母(T.glabrata)CCTCCM202019为模式菌株，采用将来源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)中编码形成水的NADH氧化酶nox基因过量表达于CCTCC M202019中，获得了一株NADH氧化酶活性为34.8U·mg-1 protein的重组菌T.glab...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈坚，徐沙，刘立明，堵国成，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]