本发明专利技术公开了一种检测光滑假丝酵母菌的实时荧光定量PCR试剂盒。包括如下物质：PCR反应液、引物探针混合液、PCR反应酶、纯H2O、阳性定量标准品。用于检测光滑假丝酵母菌核酸扩增水平，可反映患者体内光滑假丝酵母菌感染的状态，可用于真菌感染的监测和防治，有助于疾病的早期诊断和治疗；实时荧光定量PCR技术针对光滑假丝酵母菌核酸特异性序列设计引物、探针，特异性强，灵敏度高，且具有较高通量，操作简便、相对降低成本的优点，适用于大多数患者多种标本的检测。本发明专利技术的试剂盒扩增待检标本由市售的实时荧光定量PCR仪完成，操作简单，耗时少，且最大限度地减少了污染的发生。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测光滑假丝酵母菌(光滑念珠菌)的试剂盒，具体地说，涉及一种以实时荧光定量聚合酶链反应技术检测光滑假丝酵母菌的试剂盒。
技术介绍
近年来，随着免疫受损人群(包括恶性肿瘤、血液病、艾滋病、SARS、糖尿病、自身免疫病、严重烧伤和创伤、长期吸毒者等)的不断扩大；广谱抗生素、皮质类固醇激素和免疫抑制剂在临床上广泛应用；器官移植、导管插管、介入治疗等新技术的普遍开展，使机会性真菌感染的发病率急剧上升，已经成为院内感染死亡的主要原因之一。美国国家医院感染监测中心(NNIS)资料显示，20世纪90年代住院患者深部真菌感染率为80年代的1. 9倍。1995-2002年美国49所医院连续7年的监测资料表明，念珠菌败血症在医院感染败血症中居第4位，病死率则居首位。近年非白念珠菌的分离率升高，其中由光滑念珠菌引起的感染明显增加。调查显示1989—1999年，由光滑念珠菌所致的血源性感染上升，是引起念珠菌血症的第2位常见病原菌，从全球范围来看，约占念珠菌血症的15%。光滑念珠菌也是口腔黏膜的重要病原真菌，由其引起的口腔感染占艾滋病患者口腔念珠菌感染的14%。同样，光滑念珠菌是分离自尿液的第2位常见病原真菌和引起外阴阴道念珠菌病(VVC)最常见的非白念珠菌，从VVC患者病灶部位分离的念珠菌中，光滑念珠菌占；34· 5%ο与其他非白念珠菌相比，光滑念珠菌引起的感染的病死率最高，为409Γ70%，肿瘤患者和骨髓移植患者发生的光滑念珠菌血症的病死率分别高达50%和100%。由于真菌感染初期症状不明显，临床表现缺乏特征性，早期诊断困难，易导致抗真菌治疗的延迟。而真菌感染尤其是深部真菌感染时病情凶险，常贻误治疗时机。加上光滑假丝酵母菌对常用抗真菌药物包括两性霉素B的敏感性低，且近年来对氟康唑的耐药率呈上升趋势，致使临床使用常见抗真菌药物治疗效果不佳。因此快速准确的诊断和鉴定感染真菌种类对指导治疗用药十分重要，能显著提高机会性真菌感染患者的生存率。目前真菌感染的临床鉴定主要依赖于显微镜下孢子和菌丝的形态、培养的菌落特征以及生化结果，但这些传统的诊断方法通常周期长、敏感性差、阳性率低，不能满足临床需要。作为金标准的组织病理学和深部组织培养由于其有创性而难于被患者接受。因此， 如何提高真菌感染的早期、特异诊断水平是目前临床真菌学领域的研究热点，也是临床检验中要解决的关键问题。测定循环抗原与抗体的血清学方法，由于发生真菌感染的宿主多免疫受损，缺乏可检测到的抗体，或者抗体产生的变化较大，因此检测抗体对于诊断的意义不大。目前主要检测血液循环中的抗原，如甘露聚糖、(1，；3)-β-葡聚糖及D-/L-阿拉伯糖醇(DA/LA)等， 但致病性真菌之间存在交叉抗原，导致血清学检查难以获得满意结果。分子生物学方法在临床病原性真菌检测中的应用，为提高病原性真菌的检测灵敏度和特异性提供了良好的手段。常用的分子生物学方法有PCR、核酸探针、限制性酶切反应、 PCR-RFLP, PCR-SSCP、基因芯片技术等。普通PCR因其易引起实验室污染，很少用于临床检验，通用引物PCR具有快速敏感的优势，但分离的特异性差，尤其不能对光滑念珠菌这种对部分抗真菌药物原发不敏感的菌株进行鉴定；核酸探针为增加特异性需要大量的探针，价格昂贵且耗时，不能用于常规实验室检查；PCR-SSCP、PCR-RFLP、基因芯片技术等敏感性和特异性都较好，但操作比较复杂、仪器设备要求高，多用于科研，目前均不宜用于临床检测。 因此，寻找一种能快速、敏感和特异检测病原真菌的方法成为临床的迫切需求。实时荧光定量PCR技术在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。避免了传统PCR以终产物检测定量产生的偏差，提高了实验的重复性。与常规PCR相比特异性更强，有效解决PCR产物污染，自动化程度高，敏感性通常达100拷贝/ ml，线性范围宽，重复性好，且检测时间短。 目前，实时荧光定量PCR已广泛应用，美国食品与药品管理局(FDA)已经批准了一些定量检测病原体的PCR诊断试剂盒，如用于HIV、结核分枝杆菌、沙眼衣原体等的实时荧光PCR检测的试剂盒。同样，中国目前也已批准了乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HIV和SARS等的实时荧光PCR检测试剂盒的生产和临床应用。在病原性真菌检测中的研究也有报道。在欧盟， 基于定量PCR检测融合基因的一些诊断试剂盒已经通过CE认证。因此，开发一种能够检测光滑假丝酵母菌的实时荧光定量PCR试剂盒，为临床提供新的快速早期诊断手段，以期发现更多的光滑假丝酵母菌感染，采用更有效的治疗药物和方案，救治更多的患者；同时也可监测疗效，帮助临床评价治疗效果，并有效降低医疗成本。对IFI的诊断，治疗和预后具有重要意义。众所周知，在使用已知的实时荧光定量PCR技术检测和定量分析临床样品中某特定靶核酸的实践中，为了减少和避免检测结果的假阴性或假阳性，提高定量分析的准确性， 一个关键性的基本技术环节和技术难点是如何基于已知的靶多核苷酸序列设计并制备适当的引物和寡核苷酸探针。本专利技术人在以往多年从事PCR技术特别是实时荧光定量PCR技术研究的基础上，开发相应的试剂盒应用于光滑假丝酵母菌的检测和定量分析，成功地完成了本专利技术，并通过了一定样本量的临床试用和评价。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用实时荧光聚合酶链式反应技术进行光滑假丝酵母菌检测的试剂盒，利用本试剂盒可以准确鉴别并定量光滑假丝酵母菌。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案根据GENBANK上公布的核酸序列，寻找光滑假丝酵母菌核酸序列的特异性保守区，并针对保守区设计靶核苷酸引物和探针。这些引物探针在DNA聚合酶、PCR反应酶以及PCR反应液中，通过荧光PCR仪实现体外核酸的循环扩增。本专利技术设计的光滑假丝酵母菌特异性的正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1 所示。本专利技术设计的光滑假丝酵母菌特异性的反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO 2 所示。本专利技术设计的光滑假丝酵母菌的特异性探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示。 所述探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团ECLIPSE。一种检测光滑假丝酵母菌的实时荧光定量PCR试剂盒，包括如下物质 PCR反应液、引物探针混合液、PCR反应酶、纯H2O和阳性定量标准品。所述PCR 反应液由 Tris-HCl (50mmol/L，ρΗ8· 0)、MgCl2 (8mmol/L)和 KCl (250mmol/L)组成。所述引物探针混合液中引物浓度均为0. 2mmol/L，探针浓度均为0. lmmol/L。所述PCR反应酶由Hotstart Taq DNA聚合酶和dNTPs组成。Taq酶、dNTPs均可采用市售产品；如TaKaRa公司的产品，其中每人份PCR反应酶系中Hotstart Taq DNA聚合酶的用量为5U，dNTPs用量为lOmmol/L。所述阳性定量标准品为含有序列为SEQ ID NO :4的DNA片段的pMD19_T重组质粒。其中所述阳性定量标准品的制备方法由以下步骤组成(1)以提取的光滑假丝酵母菌DNA为模板，用序列为SEQN0.5和SEQ NO. 6本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．光滑假丝酵母菌特异性的正向引物，其核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示。
【技术特征摘要】
1.光滑假丝酵母菌特异性的正向引物，其核苷酸序列如SEQID N0:1所示。2.光滑假丝酵母菌特异性的反向引物，其核苷酸序列如SEQID N0:2所示。3.光滑假丝酵母菌的特异性探针，其核苷酸序列如SEQID N0:3所示。4.如权利要求3所述的特异性探针，其特征在于所述探针的两端分别结合有荧光发生基团FAM和荧光淬灭基团ECLIPSE。5.一种检测光滑假丝酵母菌的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于包括如下物质PCR反应液、引物探针混合液、PCR反应酶、纯H20、阳性定量标准品。6.如权利要求5所述的检测光滑假丝酵母菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于所述 PCR 反应液由 Tris-HCl (50mmol/L, ρΗ8· 0)、MgCl2 (8mmol/L)和 KCl (250mmol/L)组成。7.如权利要求5所述的检测光滑假丝酵母菌的荧光定量PC...
【专利技术属性】
技术研发人员：王前，龙燕，郑磊，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：81
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