一种来源于肺炎克雷伯氏菌的漆酶及其重组菌株与制备制造技术

本发明专利技术属于酶的基因工程技术领域，涉及一种来源于肺炎克雷伯氏菌的新型漆酶及其制备的方法，其技术方案是利用分子生物学手段和基因工程技术，通过菌种筛选获得一株能够产生漆酶的肺炎克雷伯氏菌，通过PCR技术扩增出该新型漆酶的基因，然后将该新型漆酶基因，分别在枯草芽胞杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统中进行表达，分别得到枯草芽胞杆菌高稳定性漆酶重组菌株和毕赤酵母高稳定性漆酶游离表达重组菌株，实现新型漆酶的制备。同时该新型细菌漆酶对偶氮类和蒽醌类染料具有较好的脱色效果。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术涉及一种来源于肺炎克雷伯氏菌的新型漆酶及其基因、工程菌和制备方法，具体涉及通过基因工程技术和分子生物学手段获得表达该新型漆酶的重组表达菌株，以及该细菌漆酶蛋白在染料脱色工业上的应用，属于酶的基因工程

技术介绍
：漆酶(Laccase，E.C.1.10.3.2)，又称漆酚氧化酶、多铜氧化酶，是一种含铜的多酚氧化酶，它与植物中的抗坏血酸氧化酶、哺乳动物的血浆铜蓝蛋白、细胞色素C氧化酶、胆红素氧化酶同源，属于蓝色多铜氧化酶家族的一员。它能够催化多种酚类和非酚类化合物氧化，使之生成相应的苯醌，同时伴随电子的转移，将分子氧还原成水，且反应过程中无其它副产物生成。漆酶是一种被公认为环境友好的“绿色酶”，在自然界中分布十分广泛。漆酶按其来源可以分为4大类：植物漆酶、动物漆酶、真菌漆酶和细菌漆酶。漆酶最早发现于日本漆树的汁液成分中，在随后的研究中，研究者从多种植物中均发现漆酶，但是植物漆酶在提取过程中包含大量的其它氧化酶，使得纯化漆酶过程较为复杂。后来又证实，漆酶除了存在于植物中，还存在于动物、真菌和细菌中。真菌漆酶主要存在于高等真菌(特别是担子菌)中，目前工业化的商品漆酶主要来源于真菌，但是，真菌漆酶易受羟基离子的影响，在碱性条件下活性非常低或者几乎没有，热稳定性也较差，且丝状真菌生长周期长，对培养基要求较高，在发酵罐中容易受到高剪切力的损伤，且真菌漆酶需要进行翻译后修饰，只能依靠筛选高产菌株自身表达或者使用真核表达系统进行重组表达，存在生产周期长、成本高、产量低等缺点，这严重影响了真菌漆酶在工业上的应用。细菌漆酶包括芽胞杆菌属的CotA蛋白、海单胞菌的PpoA蛋白、大肠杆菌CueO蛋白等，与真菌漆酶相比，细菌漆酶可以克服真菌漆酶的上述缺点，并且在碱性条件下具有良好的催化活性和较高的稳定性。细菌漆酶具有自己一些独特的优点，如：无需糖基化修饰、酶的最适pH范围广、温度稳定性好、存在Cu2+抗性等。这些性质正是目前工业上漆酶应用所需要的。因此，细菌漆酶的研究对于漆酶应用领域的扩展具有十分重要的意义。目前，关于细菌漆酶的研究很少，更多具有高活力高稳定性能力的细菌漆酶基因有待进一步发掘和研究。由于漆酶来源不同，并且不同来源的漆酶在结构和性质方面存在一定的差别，因此不同来源的漆酶在其催化特性方面会表现出一定的差异。漆酶的作用底物及其广泛，能够催化氧化包括多酚类、二胺、芳胺类、羧酸类在内的250多种有机物发生氧化、聚合等反应。因其特殊的催化性能和宽泛的作用底物，所以漆酶的应用也及其广泛，包括污染物降解、染料脱色解毒、纸浆和纺织品漂白、口腔保健牙齿美白剂、漂白衣物洗涤剂、食品风味改良、饲料营养改善、生物电子研发等。对于许多应用，可以通过使用介体来提高漆酶的氧化能力。目前已知的介体包括：HBT(1-羟基苯并三唑)、ABTS(2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐、丁香酸甲酯、NHA(N-羟基乙酰苯胺)、NEIAA(N-乙酰基-N-苯基羟胺)、HBTO(3-羟基1,2,3-苯并三嗪-4(3H)酮)、VIO(紫尿酸)。枯草芽胞杆菌属于革兰氏阳性菌。枯草芽胞杆菌表达系统具有以下优点：1、能够高效的分泌各种蛋白质；2、许多枯草芽胞杆菌在发酵工业上的使用已有相当长的历史，无致病性，不产生任何内毒素；3、芽胞杆菌属微生物遗传学背景研究的十分清楚，并且生长迅速，对营养物质无特殊要求等优点；4、密码子偏爱性不明显；5、发酵过程简单，枯草芽胞杆菌属于好氧菌，无需厌氧发酵设备，发酵结束后，简单的分离发酵液和细菌菌体，即可进入目的蛋白的分离、纯化回收阶段；6、具有抗逆性，可以生产多种耐热性酶制剂。毕赤酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速。毕赤酵母系统用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。毕赤酵母表达系统在表达外源目的蛋白时具有很多优点，具有广阔的前景，适合工业化和规模化生产，该表达系统的优点主要表现在：1、表达量高：毕赤酵母表达系统的表达载体，是以醇氧化酶基因的启动子启动表达的，其外源目的蛋白的表达量很高，P.pastoris的表达量比一般表达系统的表达量(常用表达系统的表达量一般在毫克级)高10倍甚至100倍。2、稳定性高：毕赤酵母表达系统的表达载体通过整合在酵母的染色体上而存在，并且随染色体的复制而复制，不是以质粒自我复制的形式存在，因此重组菌株的稳定性很高。3、高分泌表达：毕赤酵母表达系统的表达载体中a因子前导序列是一个具有很好的分泌效果的分泌信号序列，能够通过一定的途径使表达产物分泌到细胞外，同时减轻了宿主细胞的代谢负荷，有利于细胞的持续生长。4、目的蛋白翻译后的加工和修饰：毕赤酵母具有真核生物完整的亚细胞结构，能够进行真核生物蛋白翻译后的加工修饰过程(如糖基化、脂酞化、磷酸化、蛋白裂解、折叠以及二硫键的形成等)，从而使分泌蛋白的结构更接近于天然蛋白，而且糖基化程度合适，适于临床使用。5、遗传背景研究较清楚，能够通过基因表达调控机制实现目的蛋白的高水平表达。6、易于进行工业化生产，毕赤酵母属于单细胞微生物，具有生产成本低，营养要求简单(酵母的碳源一般为甘油、葡萄糖以及甲醇等)，发酵工艺简单，可进行高密度发酵等优点，酵母具有大规模发酵生产外源蛋白的潜力，而且酵母表达系统自我分泌的杂蛋白很少，对于目的蛋白的纯化有利。毕赤酵母表达系统已成为现代分子生物学研究最重要的工具和模型，是表达外源基因较为理想的工具。在本专利技术中，新型漆酶编码基因来源于肺炎克雷伯氏菌，它属于细菌，对肺炎克雷伯氏菌基因组中新型漆酶编码基因进行克隆，新型漆酶基因在枯草芽胞杆菌表达系统和毕赤酵母表达系统中进行表达，分别得到枯草芽胞杆菌高稳定性漆酶重组菌株和毕赤酵母高稳定性漆酶游离表达重组菌株，重组菌株发酵后，经过相应的处理，可以得到高稳定性漆酶催化剂，并且该新型重组漆酶可以对蒽醌类和偶氮类染料进行脱色。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于克服和避免目前工业上生产漆酶所存在的不足之处，并提供一种来源于肺炎克雷伯氏菌的新型细菌漆酶编码基因及表达该新型细菌漆酶基因的工程菌株。本专利技术实现目的的技术路线如下：以肺炎克雷伯氏菌的基因组为模板，并根据已报道的肺炎克雷伯氏菌漆酶成熟肽基因，分析其保守序列，设计本专利技术的漆酶成熟肽基因的扩增引物P1和P2、P3和P4，其中，上游引物P1和下游引物P2是用来扩增在枯草芽胞杆菌中表达的目的基因，上、下游引物分别引入限制性酶切位点BamHI、HindIII；上游引物P3和下游引物P4是用来扩增在毕赤酵母GS115中表达的目的基因，上、下游引物分别引入限制性酶切位点EcoRI、NotI。通过PCR克隆获得肺炎克雷伯氏菌的漆酶基因Lac，将其与pBSA43载体和pPIC9K载体分别连接后，构建重组质粒pBSA43-Lac和pPIC9K-Lac；转化大肠杆菌JM109，获得重组菌株JM109/pBSA43-Lac和JM109/pPIC9K-Lac。再次将验证正确的重组质粒pBSA43-Lac和pPIC9K-Lac，分别在枯草芽胞杆菌WB600和毕赤酵母GS115中成功表达，得到产高稳定性新型漆酶的重组菌株，进一步通过发酵工艺优化获得高产的高稳定性新型漆酶。为了实现上述目的，本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种来源于肺炎克雷伯氏菌的新型细菌漆酶，其特征在于，所述细菌漆酶的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID No：2所示。

【技术特征摘要】
1.一种来源于肺炎克雷伯氏菌的新型细菌漆酶，其特征在于，所述细菌漆酶的氨基酸序列如序列表中的SEQIDNo：2所示。2.根据权利要求1所述的一种来源于肺炎克雷伯氏菌的新型细菌漆酶，其特征在于，编码所述细菌漆酶的基因为Lac,其碱基序列如序列表SEQIDNo：1所示。3.根据权利要求1所述的一种来源于肺炎克雷伯氏菌的新型细菌漆酶，其特征在于，所述细菌漆酶的制备方法包括如下步骤：(1)将权利要求2所述的基因进行酶切，与表达载体连接得到了新的重组载体；(2)将重组载体转化入宿主细胞中，得到重组菌株，之后将重组菌株发酵，得到高稳定性细菌漆酶。4...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘逸寒，黄琳，路福平，郭伟，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12