一种β-胡萝卜素单加氧酶的制备方法及其应用技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，涉及一种β‑胡萝卜素单加氧酶的制备方法及其应用。一种β‑胡萝卜素单加氧酶的制备方法，构建β‑胡萝卜素单加氧酶基因的原核表达载体，将原核表达载体导入大肠杆菌中表达，经Ni‑NTA柱亲和层析和分子筛纯化后，得到纯化的普β‑胡萝卜素单加氧酶。所述β‑胡萝卜素单加氧酶作为催化剂，在反应液中催化底物β‑胡萝卜素，反应温度45‑55℃，反应时间20‑30 h，反式视黄醛的转化率达89.5%。本发明专利技术建立了栖热菌β‑胡萝卜素单加氧酶制备全反式视黄醛的方法，并优化了反应条件，经优化后全反式视黄醛转化率达到89.5%。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，涉及一种β-胡萝卜素单加氧酶的制备方法及其应用。
技术介绍
全反式视黄醛，又称维生素A醛，是维生素A合成的重要前体，在抵抗肌肤衰老方面具有重要生理功能。全反式视黄醛通过生理作用可以转化为活性维生素A，具有双重抗衰老作用，不仅促进细胞代谢，还能提亮肤色。全反式视黄醛可被氧化为反式视黄酸，在免疫缺陷病及癌症治疗中具有重要作用。此外，全反式视黄醛是传统的β-胡萝卜素制备工艺的重要中间体。全反式视黄醛一般通过视黄醇氧化反应获得，由于视黄醇的分子结构中具有多个共轭双键，对热、光或氧气等极不稳定，在氧化反应过程中容易形成多种氧化产物,同时氧化剂使用会产生大量污染物，因此很难适用于工业化生产（Helv.Chim.Acta40,265(1957)；中国专利200710157075.0；中国专利93118128.3）。通过对β-紫罗兰酮和环柠檬醛侧链上进行增碳反应（Tetrahedron.Lett.35,7383(1994);Chem.Lett.1201(1975)），也可以合成全反式视黄醛，但是由于该方法中β-紫罗兰酮和环柠檬醛的价格昂贵，并且需要多个反应步骤，因此也不适用于工业生产。鉴于目，提出一种利用β-胡萝卜素单加氧酶制备全反式视黄醛方法。
技术实现思路
本专利技术为解决前化学合成方法制备全反式视黄醛的不足的技术问题，提供了一种β-胡萝卜素单加氧酶的制备方法及其应用。为解决上述技术问题，采用以下技术方案：一种β-胡萝卜素单加氧酶的制备方法，构建β-胡萝卜素单加氧酶基因的原核表达载体，将原核表达载体导入大肠杆菌中表达，经Ni-NTA柱亲和层析和分子筛纯化后，得到纯化的普β-胡萝卜素单加氧酶。所述β-胡萝卜素单加氧酶基因来源于弓形栖热菌，保藏号为CGMCCNO.1.6992。一种β-胡萝卜素单加氧酶的应用，所述β-胡萝卜素单加氧酶作为催化剂，在反应液中催化底物β-胡萝卜素，反应温度45-55℃，反应时间20-30h，反式视黄醛的转化率达89.5%。所述反应液的成分为：50mmol/LNaCl、5mmol/LFeSO4·7H2O、20mmol/LTCEP、2%（w/v）OTG、1%（w/v）Tween80、5mmol/LDTT、50mmol/LpH8.0的Tricine/KOH缓冲液。所述催化剂的浓度为4U/mL，底物浓度为1000mg/L。本专利技术的有益效果在于：（1）本专利技术得到了一种栖热菌β-胡萝卜素单加氧酶的基因序列和氨基酸序列，该酶是在弓形栖热菌Thermusarciformis中发现并制备获得的第一个β-胡萝卜素单加氧酶；（2）本专利技术获得了一种不同于已发现β-胡萝卜素单加氧酶的新型酶资源，该β-胡萝卜素单加氧酶具有不同的氨基酸序列和酶学特性；（3）本专利技术建立了栖热菌β-胡萝卜素单加氧酶制备全反式视黄醛的方法，并优化了反应条件，经优化后全反式视黄醛转化率达到89.5%。附图说明图1为纯化后的β-胡萝卜素单加氧酶SDS-PAGE分析，其中M：蛋白Marker；1、2和3道为纯化后栖热菌β-胡萝卜素单加氧酶；图2为β-胡萝卜素单加氧酶的最适反应温度曲线图；图3为β-胡萝卜素单加氧酶的最适pH曲线图；图4为β-胡萝卜素单加氧酶具有转化制备全反式视黄醛HPLC结果；图5为酶浓度对全反式视黄醛产量的影响；图6为底物浓度对全反式视黄醛产量的影响；图7为在最佳反应条件下全反式视黄醛产量。具体实施方式1.一种弓形栖热菌（Thermusarciformis）β-胡萝卜素单加氧酶的制备方法，包括菌株、质粒、工具酶、培养基，引物设计，PCR扩增及重组质粒的构建，基因的诱导表达与蛋白质的纯化。具体步骤如下：（1）菌株、质粒、酶与培养基：大肠杆菌EscherichiacoliDH5α、限制性内切酶NdeI和BamHI、PyrobestDNA聚合酶、DNA连接酶、细菌基因组DNA提取试剂盒kitver.3.0购自TAKARA公司；大肠杆菌EscherichiacoliBL21（DE3）购自Novagen公司；LB培养基：每升含Tryptone10g,Yeastextract5g,NaCl10g；氨苄青霉素浓度为100mg/L,氯霉素浓度为34mg/L；弓形栖热菌（Thermusarciformis）保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.1.6992；克隆与表达质粒载体pET22b购自Novagen公司。（2）弓形栖热菌T.arciformis菌株培养：弓形栖热菌T.arciformis培养基成分(1L):Tryptone1g,Yeastextract1g,安三乙酸0.1g，CaSO40.05g,MgSO4·7H2O0.1g,NaNO30.8g,KNO30.1g,K2HPO40.2g,微量元素溶液1mL。微量元素溶液成分(1L):NaCl8g,FeCl3·6H2O0.5g,MnSO4·H2O2.5g,ZnSO4·7H2O0.5g,H3BO30.5g,CuSO4·5H2O0.025g,Na2MoO4·2H2O0.025g,CoCl2·6H2O0.5g。以1mol/LNaOH调pH为7.2,121℃灭菌30min后加入适量无菌的0.5mol/LNa2CO3/NaHCO3溶液调pH为9.0。培养条件：70℃、转速200r/min震荡培养24h至OD600nm为0.5左右。将菌液转至灭菌的50mL离心管，4℃下4,000g离心10min，弃上清，收集菌体。（3）PCR扩增及重组质粒的构建：利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取弓形栖热菌T.arciformis基因组DNA（提取方法见试剂盒说明书）。按照目前已经报道β-胡萝卜素单加氧酶保守氨基酸序列，设计引物，上游引物如SEQIDNO：1所示，其中CATATG为NdeI酶切位点；下游引物如SEQIDNO：2所示。其中GGATCC为BamHI酶切位点。以弓形栖热菌T.arciformis基因DNA为模板，PCR技术扩增β-胡萝卜素单加氧酶基因片段,PCR反应体系（100μL）如下：模板1μL（50ng）,dNTP(25mmol/L)2μL，引物（100μmol/L）各1μL，MgCl2(25mmol/L)2μL，10×缓冲液10μL，ProbestTMDNA聚合酶(5U/μL)1μL，超纯水82μL。PCR反应条件：95℃4min；95℃30s，56℃30s，72℃2min，35个循环。将质粒pET22b及经琼脂糖凝胶回收β-胡萝卜素单加氧酶基因片段，使用限制性内切酶NdeI和BamHI分别进行双酶切，双酶切液进行回收。双酶切反应体系（20μL）如下：PCR产物/pET22b16μL（400ng），NdeI内切酶（15U/μL）1μL，BamHI内切酶（15U/μL）1μL，10×缓冲液2μL。双酶切反应混合液30℃反应6h。进一步通过目的基因与载体pET22b的连接，获得重组质粒，并进行双酶切（如图1所示）及测序验证。经测序分析鉴定得到β-胡萝卜素单加氧酶基因的序列，如SEQIDNO：3所示；β-胡萝卜素单加氧酶的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。（4）基因的诱导表达与蛋白质的纯化：将本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种β‑胡萝卜素单加氧酶的制备方法，其特征在于：构建β‑胡萝卜素单加氧酶基因的原核表达载体，将原核表达载体导入大肠杆菌中表达，经Ni‑NTA柱亲和层析和分子筛纯化后，得到纯化的普β‑胡萝卜素单加氧酶。

【技术特征摘要】
1.一种β-胡萝卜素单加氧酶的制备方法，其特征在于：构建β-胡萝卜素单加氧酶基因的原核表达载体，将原核表达载体导入大肠杆菌中表达，经Ni-NTA柱亲和层析和分子筛纯化后，得到纯化的普β-胡萝卜素单加氧酶。2.如权利要求1所述的β-胡萝卜素单加氧酶的制备方法，其特征在于：所述β-胡萝卜素单加氧酶基因来源于弓形栖热菌，保藏号为CGMCCNO.1.6992。3.一种β-胡萝卜素单加氧酶的应用，其特征在于：所述β-胡萝卜素单加氧酶作为催化剂，在反应液中催化底物β-胡萝卜素，反应温度45-55...

【专利技术属性】
技术研发人员：毛多斌，魏涛，黄申，郑亚东，臧杰，王晶，李杰，
申请(专利权)人：郑州轻工业学院，
类型：发明
国别省市：河南;41