催化切割β-胡萝卜素的新型双加氧酶制造技术

本发明专利技术提供了转化细菌、真菌（包括酵母）、动物、和植物细胞、种子、组织、和完整植株以产生能够表达新型β－胡萝卜素双加氧酶并积累胡萝卜素／类视黄质途径重要代谢物（诸如维生素Ａ醛和视黄酸）的转化体的手段和方法。本发明专利技术还提供了通过生物技术使用天然或转化后积累β－胡萝卜素或者由培养基摄取β－胡萝卜素的细胞、组织、器官、或完整植株生产类视黄质的手段和方法。本发明专利技术还提供了编码衍生自不同来源和分类群的存活生物体、对称和不对称切割β－胡萝卜素的双加氧酶且设计适用于进行本发明专利技术方法的ＤＮＡ分子，及包含所述分子的质粒或载体系统。另外，本发明专利技术提供了展示改良的营养品质或生理状况且包含这些ＤＮＡ分子和／或使用本发明专利技术方法生成的转基因细菌、真菌（包括酵母）、动物、和植物细胞、种子、组织、和完整植株。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及转化细菌、酵母、真菌、昆虫、动物、和植物细胞、种子、组织、和完整生物体的领域。更具体的说，本专利技术涉及将编码类胡萝卜素/类视黄质(retinoid)生物合成途径的一种或多种特定酶的重组核酸序列整合到合适宿主细胞或生物体中，它们在转化之后展示期望表型，而且可用于例如商业生产。另外，本专利技术提供了通过生物技术来实现氧化切割C40类胡萝卜素而产生类胡萝卜素/类视黄质途径的不同特征性代谢物的手段和方法。
技术介绍
维生素A(视黄醇)及其衍生物(视黄醛、视黄酸)(在说明书全文中使用术语“类视黄质”)代表在动物中涉及广泛基础生理过程的一组化学类化合物。它们在例如视觉、生殖、代谢、细胞分化、骨骼发育、和胚胎形成过程中的图式形成中是必不可少的。为了研究类视黄质(诸如维生素A)的作用，已经使用了几种物种(如小鼠、大鼠、鸡、和猪)作为脊椎动物模型生物体，而在无脊椎动物中大多数研究是用黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)进行的。蝇视觉系统数十年来一直作为使用电生理学、光化学、遗传学、和分子生物学研究受体多样性和维生素A利用的模型。维生素A及其最重要的衍生物视黄醛和视黄酸(RA)由20个碳原子组成(C20)且属于化学类的类异戊二烯。动物通常不能从头合成类视黄质。动物的类视黄质生物合成依赖于由食物摄取具有维生素A原活性的类胡萝卜素。在那些能够由类胡萝卜素合成类视黄质的动物中，必须酶促切割维生素原。例如在哺乳动物中，已经在衍生自小肠和肝的粗提物中描述了这种酶活性。该酶催化对称氧化切割β-胡萝卜素而形成两个分子视黄醛，在生化上表征为15，15’-β-胡萝卜素双加氧酶(β-diox I)。这些酶在整个动物界中参与类胡萝卜素代谢/类视黄质形成。例如，附图说明图1和图9图解了在哺乳动物中描述的类视黄质形成的生物合成途径。除了β-胡萝卜素，还可以切割叶黄素(含氧类胡萝卜素)，只要它们具有未取代β-芷香酮环(如β-隐黄素)即可；而且在不同的动物物种中，已经报导了对不同于β-胡萝卜素的类胡萝卜素进行代谢而形成羟化类视黄质的能力(如昆虫纲中的玉米黄质和黄体素)。为了进一步代谢，必须酶促修饰产生的视黄醛而形成视黄醇(维生素A)或视黄酸。在细菌和植物中也发现了对类胡萝卜素的酶促氧化切割。在高等植物中发现了偏心切割类胡萝卜素的许多范例。这些范例包括番红花(crocus)中saffron的形成、柑橘水果中柠乌素和其它阿朴类胡萝卜素的形成，最有趣的是植物激素脱落酸(ABA，参与例如秋季落叶和种子休眠的一种生长调节剂)。ABA衍生自在11-12碳双键处氧化切割9-顺式-环氧-类胡萝卜素。最近，对ABA生物合成缺陷的玉米突变体vp14的研究提供了对这种切割反应更好的分子理解，并克隆和分子表征了动物来源的第一种类胡萝卜素切割酶(β-diox I)。由该发现提出了问题，即相似的酶是如何参与动物的类胡萝卜素代谢/类视黄质代谢，催化氧化切割具有维生素A原活性的类胡萝卜素。在随后的实验中，的确鉴定并表征了相似的酶(β-diox II)，它们也参与类胡萝卜素/类视黄质途径并特异切割β-胡萝卜素而形成β-阿朴胡萝卜素醛(β-apocarotenal，视黄酸的前体)。因而，除了β-diox I是一类新型β-胡萝卜素特异酶以外，依照本专利技术能够鉴定的另一类新型酶(β-diox II)也进行对相同底物即β-胡萝卜素的氧化切割。在动物中，已经在体外对这些重要类型的酶在类胡萝卜素代谢/类视黄质形成中的功能研究了近40年。然而，试图分离并纯化这样的蛋白质和鉴定它们的分子结构的所有尝试都失败了。这些酶的分子结构的公开(包括它们的核苷酸序列(cDNA)和它们的氨基酸序列)对于研究维生素A/类视黄质在动物和在医学中的作用的多个领域而言将是重要的。另外，该遗传物质可用于转化完整的存活生物体，从而得以在例如植物和微生物中生成类视黄质(诸如维生素A和视黄酸)以增加它们的营养价值。在脊椎动物中，已经有争议的讨论了在维生素A及其衍生物的生物合成中对β-胡萝卜素的对称/不对称切割。除了β-diox I，本专利技术还提供了对来自小鼠、人、和斑马鱼的cDNA的鉴定，它们编码称为β-dioxII的第二类胡萝卜素双加氧酶，该酶专一催化不对称氧化切割β-胡萝卜素而形成β-阿朴胡萝卜素醛和β-芷香酮(已知是来自例如玫瑰的花香物质)。除了β-胡萝卜素，该酶还氧化切割番茄红素。它的推导氨基酸序列与β，β-胡萝卜素-15，15’-双加氧酶享有显著的序列同一性，而且两类酶即β-diox I与β-diox II具有几个保守基元。至于它们的功能，由该酶形成的阿朴胡萝卜素醛担当视黄酸生物合成的前体(以及其它可能的生理学作用)。因而，与果蝇相反，在脊椎动物中对胡萝卜素的两种(对称和不对称)切割途径都存在，在这里揭示了胡萝卜素代谢的更高复杂性。在人中，正如普遍知道的，视黄醛(即β-diox I的切割产物)是视觉的决定性因素。同样清楚的是，决定完整生物体或单个细胞中视黄酸直接前体可利用性的酶对视黄酸信号途径及由此介导的细胞应答将具有广泛影响。类视黄质具有几种医学应用，如癌症治疗。作为(预防性或治疗性)药物制剂中的活性成份，类视黄质可用于预防和/或治疗不同类型的癌症。例如，动物模型显示类视黄质可调控细胞生长、分化、和凋亡，并在几种组织(诸如肺、皮肤、乳腺、前列腺、和膀胱)中遏制癌发生。后者还应用于对展示口腔、子宫颈、支气管上皮、皮肤、及其它组织和器官恶变前或恶性损伤的患者的临床研究。有些类视黄质在体外甚至对高度恶性细胞显示抗肿瘤活性，正如通过抑制增殖和诱导分化或凋亡所证明的。治疗效果的突出范例是全-反式视黄酸引起前髓细胞白血病细胞分化成粒细胞，全-反式视黄酸目前成功的用于治疗这类癌症(Nason-Burchenal和Dmitroysky，在《Retinoids》(类视黄质)中，第301页，1990；Xu和Lotan，在《Retinoids》(类视黄质)中，第323页，1999)。本专利技术首次提供了参与动物类胡萝卜素/类视黄质代谢、催化氧化切割具有维生素A原活性的类胡萝卜素的酶的完整分子表征。本专利技术的成就，包括编码这些基因类型的完整核苷酸序列的发现，能够通过提供依照本专利技术转化的植物或其部分来改进营养状况，尤其是在不发达国家。依照本专利技术，提供了称为β-diox II的一类新型酶，它也进行对β-胡萝卜素的氧化切割。但是与β-diox I相反，它产生β-阿朴胡萝卜素醛即视黄酸的第二种已知前体。因此，本专利技术提供了特异氧化切割β-胡萝卜素并积累视黄酸前体的两类新型酶。例如，维生素A缺乏是以谷物为生(诸如以稻米作为主要或几乎唯一主食)的世界人口部分中导致严重临床症状的很严重健康问题。仅在东南亚，估计每年有500万儿童形成眼疾干眼病，其中25万最终失明。另外，虽然维生素A缺乏不是死亡的终极决定因素，但是它与潜在致命的苦恼诸如腹泻、呼吸道疾病、和儿童疾病(诸如麻疹)的易感性升高有关联。依照UNICEF汇编的统计结果，改进维生素原营养每年能够在1-4岁儿童中防止100-200万人的死亡，还能防止稍后的孩童时期中25-50万人的死亡。出于这些原因，非常希望提高主食中的维生素A水平。在发达国家，维生素缺乏不再形成普遍问本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有特异切割β－胡萝卜素和番茄红素而分别形成β－阿朴胡萝卜素醛和β－芷香酮及阿朴番茄红素醛的生物学活性的分离β－胡萝卜素双加氧酶（β－ｄｉｏｘ Ⅱ）多肽或其功能片段。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：J冯林提格，K沃格特，
申请(专利权)人：辛根塔参与股份公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]