醇类的氧化还原自足性生物催化胺化制造技术

本发明专利技术涉及用于产生伯胺和仲胺的新生物催化方法，所述方法包括同时再生所需辅因子的偶联的酶促氧化和还原过程；利用在一锅法(即生物催化级联)中同时发挥作用的两种酶即醇脱氢酶和胺脱氢酶。另外，整个过程是氧化还原中性的，因为从第一氧化性步骤产生的氢化物在第二还原性步骤中内部再循环。本发明专利技术还涉及促成所需酶活性的重组表达系统和微生物；和开展这类方法的生物反应器。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及用于产生胺的新生物催化方法，所述方法包括同时再生所需辅因子的偶联的酶促氧化和还原过程；利用在一锅法(即生物催化级联)中同时发挥作用的两种酶即醇脱氢酶和胺脱氢酶。另外，整个过程是氧化还原中性的，因为从第一氧化步骤产生的氢化物在第二还原性步骤中内部再循环。因此，不要求外部还原当量；这种体系定义为氧化还原自足。本专利技术还涉及促成所需酶活性的重组表达系统和微生物；和开展这类方法的生物反应器。
技术介绍
羟基官能团普遍存在于可再循环资源和基于生物的原料(例如，醇类、糖)中，而胺部分在自然界中稀少。然而，胺广泛用于生产药物、精细化学品、农用化学品、聚合物、染料、颜料、乳化剂和增塑剂。在不同类型的胺当中，伯胺是尤其有用的工业应用中间体。因此，醇(伯醇或仲醇)向对应伯胺的官能团互变仍然在有机合成中有巨大意义。实际上，按实验室规模以及产业规模生产胺主要依赖于还原性胺化对应的羰基化合物。相反，以氧化还原中性形式直接胺化醇允许最大化该过程的原子效率，因为不需要外部氧化还原当量。按数千吨规模进行简单醇(如甲醇和乙醇)的不均一催化胺化。(K.Weissermel,H.-J.Arpe,IndustrialOrganicChemistry,第4版,Wiley-VCH,Weinheim,2003,第51页)。归因于有限的多相催化剂活性，要求相对苛刻的条件(>200℃)用于醇胺化。另外，结构上更多样的醇以极低的化学选择性转化或根本不转化。在使用叔戊基醇作为溶剂的均相体系中使用[Ru(CO)ClH(PPh3)3]Xantphos催化剂时，始于醇的胺的氧化还原中性直接合成是可能的(S.Imm,S.M.Zhang,L.Neubert,H.Neumann,F.Klasovsky,J.Pfeffer,T.Haas和M.Beller,Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,7599–7603)。Ru催化剂在第一氧化性步骤中从醇剥离氢化物以产生作为中间体的羰基化合物和Ru-H种类。在氨存在下，羰基化合物与相关的亚胺处于平衡。因此，Ru-H形式的催化剂将氢化物转移回到亚胺中间体，最终产生胺产物。化学催化过程的主要缺点是：1)化学选择性低(即第一催化性循环后生成的伯胺可以在后续循环中与氨竞争，产生伯胺、仲胺和甚至叔胺的混合物；2)缺少立体选择性，3)底物浓度极低(1mM)；4)催化剂载量高(3mol％)；5)相对苛刻的反应条件(150℃，在压力下氨作为气体)；6)需要氩气氛。尽管该领域中大部分报道的工作涉及非手性底物，但最近公开了醇的立体选择性借氢胺化(Y.Zhang,C.-S.Lim,D.S.B.Sim,H.-J.Pan,Y.Zhao,Angew.Chem.Int.Ed.2014,126,1423-1427)。然而，这种方法还受几种经济以及环境局限困扰：1)这种方法需要高载量(5mol％)的与复杂和昂贵的有机手性配体配位的铱催化剂；2)这种方法需要高载量(10mol％)的昂贵的双萘手性磷酸作为共同催化剂，否则根本观察不到转化；3)这种方法需要比氨更复杂的伯胺(即对-茴香胺和少数其他苯胺衍生物)作为氮源；因此，不能从醇直接获得伯胺，仅可以获得苯基取代的仲胺；有意义地指出，在不同类型的胺当中，伯胺是特别有用的工业应用中间体；4)这种方法需要1.5当量醇用于对-茴香胺胺化；因此即便获得理论定量产率，至少33％的醇浪费；5)ee是中度的，少数例外。然而，ee从未超过97％；最近，已经提出了使用三种酶：醇脱氢酶(ADH)、ω-氨基转移酶(ω-TA)和丙氨酸脱氢酶(Ala-DH)的伯醇生物催化借氢胺化(方案1)(J.H.Sattler,M.Fuchs,K.Tauber,F.G.Mutti,K.Faber,J.Pfeffer,T.Haas,W.Kroutil,Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,9156-9159.)。方案1.胺化伯醇的三酶级联。在第一步骤中，ADH将醇氧化成醛，产生还原形式的NAD辅因子。在第二步骤中，ω-TA正式转移来自氨基供体(L-丙氨酸)的氨基至醛中间体。除了所需的胺之外，产生丙酮酸作为副产物。最后，通过使用氨和第一步骤中生成的还原当量(即NADH)使丙酮酸再循环返回L-丙氨酸，Ala-DH使得平衡移动。然而，必须指出：1)该循环不真正是催化性的。需要至少5当量的L-丙氨酸以观察到胺产物的形成。2)这种生物催化网络仅从伯醇开始才提供>99％胺转化率。3)适用于仲醇的相同构思导致更差的转化(54％或更低)。另外，仅对映纯的S-构象醇部分地转化成S-构象的胺(仅在构象保持时胺化)。4)ω-转氨酶非常频繁地受底物(例如酮/醛，丙氨酸)抑制作用和产物(例如胺，丙酮酸)抑制作用困扰(a)J.-S.Shin,B.-G.Kim,Biosci.Biotechnol.Biochem.2001,65,1782–1788；b)J.-S.Shin,B.-G.Kim,Biotechnol.Bioeng.1999,65,206–211；c)J.-S.Shin,B.-G.Kim,Biotechnol.Bioeng.2002,77,832–837)。5)三酶体系的使用令反应设置复杂化并且令克隆多个基因至相同宿主生物中的可能性复杂化。另外，不得不在体系中供应L-丙氨酸。6)当使用(R)-选择性ω-TA时，必须使用更昂贵的L-丙氨酸。另外，能够使丙酮酸再循环回到L-丙氨酸的丙氨酸脱氢酶并非已知。仅将产生L-丙氨酸。因此，在(R)-选择性ω-TA的情况下，该体系借助移除丙酮酸而非丙酮酸再循环发挥作用。这点也与“催化性过程”定义矛盾。显而易见，需要进一步改进的用于制备胺的生物催化方法。专利技术概述在一锅法中按依次方式以及按同时方式的多步骤化学反应避免了中间体分离步骤和纯化步骤需求。这种方法导致经济益处以及环境益处，因为不需要费时的中间体生成，并且提取/纯化用有机溶剂和蒸发/传质用能量的使用最小化。因此，级联反应通常拥有升高的原子效率和较低的环境影响因素。主要挑战是开展其中氧化性步骤和还原性步骤同时发生的级联反应。甚至更有挑战性的是实施相互联系的同时氧化还原中性级联，其中第一氧化性步骤内释放的电子在后续还原性步骤中定量消耗。这个概念是本专利技术的基础，涉及醇(伯醇或仲醇)互变成胺。令人惊讶地，上文提到的问题可以通过提供如所附权利要求书中所限定的生物催化方法解决。具体地说，通过提供新酶促催化方法解决该问题，所述方法通过仅组合两种生物催化剂(即醇脱氢酶(ADH)与胺脱氢酶(AmDH))氧化还原自足(即借氢)胺化醇，例如，通过在体外应用作为纯化的酶的所述酶，实现超过94％的转化率和完美的化学选择性和立体选择性(方案2)：方案2.醇的借氢生物催化胺化例如，R＝烷基-、芳基烷基-；和R’＝CH3-、H-在用于直接胺化醇的这种氧化还原自足网络中，其中氮源是氨，唯一副产物是水。除氨之外，不需要其他化学种类。因此，与前述生物催化过程(方案1)相反，令人惊讶地，本专利技术方法真正是催化性的。另外，这个过程拥有其他令人惊讶的优点，尤其适用性更宽，原因在于它允许：1)胺化对映纯的仲醇并立体翻转(例如从(S)-苯基-2-丙醇至(R)-苯基-2-丙胺，&本文档来自技高网...

【技术保护点】
制备胺的方法，其中所述胺具有通式I(R1)(R2)HC‑NH2   (I)其中R1和R2是相同或不同的并且选自H、烷基、环烷基、烯基、芳基、芳烷基、烷氧烷基或芳氧基烷基，条件是R1和R2不同时是H，并且其中芳基部分任选地可以是取代的，所述方法包括：a)在辅因子NAD(P)+和醇脱氢酶(ADH)(E.C.1.1.1.x)存在下酶促氧化所述胺的对应醇以形成所述醇的对应羰基化合物，而辅因子NAD(P)+经还原以形成NAD(P)H；并且b)在存在如下时酶促还原所述羰基化合物i))氨或氨源，和ii)胺脱氢酶(AmDH)以形成所需胺，而辅因子NAD(P)+从NAD(P)H再生；并且任选地c)分离所述胺；其中所述AmDH是苯丙氨酸脱氢酶(Ph‑AmDH)(E.C.1.4.1.20)的突变体或亮氨酸脱氢酶(L‑AmDH)(E.C.1.4.1.9)的突变体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.07.03 EP 14175632.01.制备胺的方法，其中所述胺具有通式I(R1)(R2)HC-NH2(I)其中R1和R2是相同或不同的并且选自H、烷基、环烷基、烯基、芳基、芳烷基、烷氧烷基或芳氧基烷基，条件是R1和R2不同时是H，并且其中芳基部分任选地可以是取代的，所述方法包括：a)在辅因子NAD(P)+和醇脱氢酶(ADH)(E.C.1.1.1.x)存在下酶促氧化所述胺的对应醇以形成所述醇的对应羰基化合物，而辅因子NAD(P)+经还原以形成NAD(P)H；并且b)在存在如下时酶促还原所述羰基化合物i))氨或氨源，和ii)胺脱氢酶(AmDH)以形成所需胺，而辅因子NAD(P)+从NAD(P)H再生；并且任选地c)分离所述胺；其中所述AmDH是苯丙氨酸脱氢酶(Ph-AmDH)(E.C.1.4.1.20)的突变体或亮氨酸脱氢酶(L-AmDH)(E.C.1.4.1.9)的突变体。2.权利要求1的方法，其中所述AmDH选自a)包含SEQIDNO:1的氨基酸序列的苯丙氨酸脱氢酶的突变体，其中所述突变体包含双突变K78S、N277L，并且其中所述突变体与SEQIDNO:1具有至少80％的序列同一性，和b)包含SEQIDNO:3的氨基酸序列的亮氨酸脱氢酶的突变体，其中所述突变体包含四重突变K68S、E114V、N262L、V291C，并且其中所述突变体与SEQIDNO:3具有至少80％的序列同一性。3.前述权利要求中一项的方法，其中所述AmDHa)是苯丙氨酸脱氢酶的突变体并且包含SEQIDNO:2或SEQIDNO:2的氨基酸残基21至400的氨基酸序列，或b)是亮氨酸丙氨酸脱氢酶的突变体并且包含SEQIDNO:4的氨基酸序列。4.前述权利要求中一项的方法，其中所述ADH选自：a)包含SEQIDNO:5的氨基酸序列或与SEQIDNO:5具有至少80％序列同一性的氨基酸序列的AA-ADH；b)包含SEQIDNO:6的氨基酸序列或与SEQIDNO:6具有...

【专利技术属性】
技术研发人员：KU·鲍尔代纽斯，M·布罗伊尔，K·迪特里希，V·纳维茨卡斯，F·穆蒂，T·克瑙斯，N·特纳，
申请(专利权)人：巴斯夫欧洲公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE