本发明专利技术公开了一种用于生产异丁香酚单加氧酶的大肠埃希氏菌及构建方法和应用，该大肠埃希氏菌命名为BL21(DE3)IEM-PP，保藏编号为CGMCC No.8918。构建方法是利用PCR技术，以土壤的全基因组DNA为模板，在PCR引物作用下扩增得到长度为1438bp的片段，经切胶回收并纯化处理后同T载体pET21(a)连接得到克隆载体重组质粒PET21(a)-IEM的重组菌BL21(DE3)IEM-PP，可以应用该重组菌生物转化异丁香酚生产香草醛。
【技术实现步骤摘要】
用于生产异丁香酚单加氧酶的大肠埃希氏菌及构建和应用
本专利技术涉及异丁香酚单加氧酶的基因工程菌的构建及其生物催化
，特别是涉及一种用于生产异丁香酚单加氧酶的大肠埃希氏菌及构建方法和应用。
技术介绍
香草醛是工业中应用最广泛的香料之一，大量用于食品工业，可作为香气修饰和定香的主要原料用于食品、牙膏、香皂、烟草中；在医药化工中作为重要的原料或中间体，可用于制造治疗高血压、心脏病、皮肤病及消除口臭、利尿的常用药物；在化学工业中可作为化学助剂，用于塑料制品的抗硬化剂以及Ni，Cr, Cd等金属的电镀光亮剂；在农业生产上，香草醛可作为作物增产剂和催熟剂，并用之制备除草剂和昆虫引诱剂等，需求量很大。香草醛目前主要由化学方法制备，但用化学合成法制得的香草醛不是天然香料。天然香草醛可以从香子兰的花荚中提取，但用植物组织提取的方法生产的天然香草醛量少而价高，不能满足日益增长的需求。随着世界各国对食品安全越来越重视，对天然香草醛的需求越来越大。天然香料是指由动植物材料经物理(包括蒸馏、溶剂萃取)方法、酶法或微生物方法得到的，可通过传统的食品加工方法(包括干燥、焙烤、发酵)加工后用于人类消费的物质。根据欧洲和美国立法，利用动植物资源通过物理方法、酶法或微生物法得到的物质才能称为天然物质(MuheimAndrea.US6, 235，507.2001)。用生物法生产的香草醛，属天然产品，可以生物降解，符合消费者追求天然产品的消费心理。因此，利用生物转化技术生产生物香兰素，是一种有效的、很有前途的替代方法。在过去的十年里报道了许多用微生物法或酶法生产香草醛的方法，一般都是通过微生物或酶将合适的前体转化为香草醛。目前，尚未有重组菌转化异丁香酚生产香草醛的任何报道。
技术实现思路
为了弥补上述现有技术的不足，本专利技术提供一种用于生产异丁香酚单加氧酶的工程菌(大肠埃希氏菌)及其构建方法和应用，该工程菌可用于生产异丁香酚单加氧酶，进而用于转化异丁香酚生产香草醛。本专利技术的技术问题通过以下的技术方案予以解决:—种用于生产异丁香酹单加氧酶的大肠埃希氏菌(Escherichia coli),该所述大肠埃希氏菌命名为BL21 (DE3) IEM-PP，保藏编号为CGMCC N0.8918。本专利技术提供的工程菌属于大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，命名为BL21(DE3)IEM-PP,已于2014年3月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏号为CGMCC N0.8918。大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL21 (DE3) IEM-PP CGMCC N0.8918简称大肠埃希氏菌BL21 (DE3)IEM-PP0该大肠埃希氏菌BL21 (DE3) IEM-PP可用于生产异丁香酚单加氧酶，并利用其转化异丁香酚生产香草醛。一种上述大肠埃希氏菌的构建方法，包括如下步骤:(I)提取土壤的全基因组DNA ；(2)根据异丁香酚单加氧酶的基因序列，设计PCR引物，所述PCR引物包括上游引物 SEQ ID N0.1 和下游引物 SEQ ID N0.2 ；(3)以所述全基因组DNA为模板，用步骤⑵中的PCR引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，切胶回收得到大小为1438bp的目标基因SEQ ID N0.3 ；(4)将目标基因SEQ ID N0.3插入T载体pET21 (a)的Ndel和XhoI酶切位点之间，得到重组质粒PET21 (a) -1EM ；(5)将重组质粒PET21(a)_IEM转化得到所述大肠埃希氏菌。一种所述的大肠埃希氏菌在生产异丁香酚单加氧酶中的应用。优选地，所述的应用包括如下步骤:(I)将所述的大肠埃希氏菌接种至发酵培养基，得到菌浓度OD6tltol = 0.1-0.2(如0.1-0.15或0.15-0.2)的 发酵初始体系；(2)将所述发酵初始体系进行如下发酵:先在35_37°C下振荡培养3_5小时，然后加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)至IPTG在所述述发酵初始体系中的终浓度为50-100 μ M，然后在25-30°C下继续振荡培养12-48小时，得到氨基酸序列为SEQ ID N0.4异丁香酚单加氧酶。优选地，所述发酵培养基pH为7.0-7.2(如7.0-7.1或7.1_7.2)，包括10_15g/L(如 10-12g/L 或 12-15g/L)胰蛋白胨、15_23g/L(如 15_19g/L 或 19_23g/L)酵母提取物、5-10g/L(如 5-7g/L 或 7-10g/L)氯化钠、10_15g/L(如 10_12g/L 或 12_15g/L)甘油、10-17mM(如 10-14mM 或 14_17mM)磷酸二氢钾和 65_75mM(如 65_70mM 或 70_75mM)磷酸氢二钾，余量为水。优选地，所述大肠埃希氏菌以种子液的形式用移液器接种至所述发酵培养基，所述种子液占所述发酵培养基的体积分数为0.5-2%，即接种量为0.5-2%，进一步优选接种量为1%。优选地，所述种子液是将所述大肠埃希氏菌接种至种子培养基，35_37°C振荡培养至菌浓度OD6tltlnm = 3-6形成。优选地，所述种子培养基pH为7.0-7.2 (如7.0-7.1或7.1-7.2)，包括10_15g/L (如 10-13g/L 或 13-15g/L)胰蛋白胨、5_8g/L (如 5_7g/L 或 7_8g/L)酵母提取物、5_10g/L(如5-7g/L或7-10g/L)氯化钠，余量为水。以上任一所述的振荡培养是在100-220r/min (如 100_150r/min 或 150_220r/min)下进行。一种香草醛的制备方法，包括如下步骤:按异丁香酚:异丁香酚单加氧酶:缓冲液=0.1~0.4g:0.2~1.2g:9~18mL加入反应容器中，在20~28°C下振摇转化12~48h，得到香草醛；所述异丁香酚单加氧酶由上述任意一项所述的应用制备得到，所述缓冲液为pH8~10.4的甘氨酸/NaOH水溶液。优选地，甘氨酸/NaOH水溶液中甘氨酸的浓度可以为50~150mM。优选地，在所述反应容器中，还添加DMS0、离子液体和香草醛吸附剂中的至少一种；每0.1~0.4g异丁香酚中:所述DMSO的加入量≤lmL，所述离子液体的加入量(100 μ L，香草醛吸附剂的加入量≤0.6g。加入的DMSO或离子液体可以与水互溶，可以促进异丁香酚在整个体系中的溶解度，而又不会使酶失活；加入的香草醛吸附剂可以吸附香草醛从而加快反应进程，增加产率。优选地，所述香草醛吸附剂为树脂和壳聚糖膜中的至少一种。本专利技术提供的工程菌和方法可用于生产异丁香酚单加氧酶，并用于转化异丁香酚生产香草醛，具备潜在工业化价值(生物法制香精香料)，为后续的工业化研究奠定了基础。【具体实施方式】以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为是从常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例一:工程菌的获得和保藏一、工程菌的构建1、采取本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于生产异丁香酚单加氧酶的大肠埃希氏菌，其特征在于：所述大肠埃希氏菌命名为BL21(DE3)IEM‑PP，保藏编号为CGMCC No.8918。
【技术特征摘要】
1.一种用于生产异丁香酚单加氧酶的大肠埃希氏菌，其特征在于:所述大肠埃希氏菌命名为 BL21 (DE3) IEM-PP，保藏编号为 CGMCC N0.8918。2.权利要求1所述的大肠埃希氏菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)提取土壤的全基因组DNA; (2)根据异丁香酚单加氧酶的基因序列，设计PCR引物，所述PCR引物包括上游引物SEQID N0.1 和下游引物 SEQ ID N0.2 ； (3)以所述全基因组DNA为模板，用步骤⑵中的PCR引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，切胶回收得到大小为1438bp的目标基因SEQ ID N0.3 ； (4)将目标基因SEQID N0.3插入T载体pET21 (a)的Ndel和XhoI酶切位点之间，得到重组质粒PET21(a)-1EM; (5)将重组质粒PET21(a) -1EM转化得到所述大肠埃希氏菌。3.—种权利要求1所述的大肠埃希氏菌在生产异丁香酚单加氧酶中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，包括如下步骤: (1)将权利要求1所述的大肠埃希氏菌接种至发酵培养基，得到菌浓度OD6tltol=0.1-0.2的发酵初始体系 ； (2)将所述发酵初始体系进行如下发酵:先在35-37°C下振荡培养3-5小时，然后加入IPTG至IPTG在所述述发酵初始体系中的终浓度为50-100 μ Μ，然后在25_30°C下继续振荡培养12-48小时，得到氨基酸序列为SEQ ID N0.4的异丁香酚单加氧酶。5.如权利要求4...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵丽青，马田田，吴序栎，李小曼，宋江宁，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。