一种白骨壤单加氧酶CMO及其编码基因与应用制造技术

一种来源于白骨壤的单加氧酶CMO及其编码基因，以及该编码基因在培育耐盐、耐旱性提高的转基因植物中的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种白骨壤单加氧酶CMO及其编码基因与应用
本专利技术涉及植物蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种来源于白骨壤的单加氧酶CMO及其编码基因，以及其在培育耐盐性及耐旱性提高的转基因植物中的应用。
技术介绍
干旱使得超过40％的地球陆地面积种植农作物受到限制，对全球农业生产和粮食供应也构成了严重的威胁，干旱是对农作物产量的主要环境限制条件之一。世界上盐碱土的面积很大，约有4亿公顷，占灌溉农田的1/3。在气候干燥的半干旱、干旱地区由于降雨量少、蒸发剧烈，盐分不断积累；海滨地区由于海水倒灌造成土壤含盐量增加。我国盐碱土主要分布于西北、华北、东北和滨海地区，随着大棚面积的逐年增长和栽培年代的推移，土壤盐渍化日趋严重。对绝大多数农作物来说，土壤中过量的Na+会对植物体的正常的生长代谢产生毒害作用。因此如何在盐渍环境下提高作物产量就成为我国农业生产中十分重要的问题。采用传统的方法选育耐盐、抗旱的植物品种固然简便可行，但进展缓慢，局限性大。随着分子生物学技术的发展，一大批与植物耐盐、抗旱有关的基因相继得到克隆，植物转基因技术有了重大突破，这为有效利用旱地及盐碱地提高作物产量，治理盐渍化及荒漠化土地提供了新的思路和方法。植物的抗逆性是一个十分复杂的数量性状，其耐盐机制涉及从植株到器官、组织、生理生化直至分子的各个水平。植物在受到胁迫时会产生相应的应答反应，来降低或消除给植株带来的危害。植物的这种应答反应是一个涉及多基因、多信号途径、多基因产物的复杂过程。这些基因及其表达产物可以分为3类：(1)参与信号级联放大系统和转录控制的基因及其表达产物；(2)直接对保护生物膜和蛋白质起作用的基因及其表达产物；(3)与水和离子的摄入和转运相关的基因及蛋白质。各国的科学家也为此做了大量的工作，并取得突破性的进展(ParkS.2005.Up-regulationofaH+-pyrophosphatase(H+-PPase)asastrategytoengineerdrought-resistantcropplants.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.102:18830-18835；ABEH.2003.ArabidopsisAtMYC2(bHLH)andAtMYB2(MYB)functionastranscriptionalactivatorsinabscisicacidsignaling.PlantCell,15:63-78；ZhangZL.2011.ArabidopsisFloralInitiatorSKB1ConfersHighSaltTolerancebyRegulatingTranscriptionandPre-mRNASplicingthroughAlteringHistoneH4R3andSmallNuclearRibonucleoproteinLSM4Methylation.PlantCell,23:396–411)。通过生物技术手段，对具有胁迫耐受能力的农作物、旱生植物和盐生植物的研究都取得了显著的成果，对胁迫相关基因和信号转导系统也有了更进一步的了解。但就目前的研究状况而言，由于其机制十分复杂，许多植物对逆境下的生物化学和生理学上的响应机制仍有待深入研究。在抗逆应答基因的功能及表达调控方面的研究占多数，但抗逆相关的信号传递途径之间的联系以及整个信号传递网络系统的机理还有待进一步研究。虽然许多研究机构通过现代生物技术，获得了各类具有一定耐盐、抗旱等抗逆能力的转基因植物，但还未达到产业化的标准。因此在提高植物抗逆性方面，还有许多工作需要做。
技术实现思路
本专利技术人利用SSH(抑制差减杂交)与RACE(cDNA末端快速扩增)相结合的方法克隆了一种白骨壤单加氧酶(本文命名为CMO)的编码基因，并测定了其DNA序列。并且发现通过转基因技术将其导入植株并使其表达后，可显著改善转基因植株的耐盐性及耐旱性，而且这些性状可稳定遗传。本专利技术第一方面提供一种白骨壤单加氧酶CMO的编码基因(本文命名为AmCMO)，其序列为SEQIDNO：2。本专利技术第二方面提供一种重组表达载体，其含有本专利技术第一方面所述的基因，其是通过将所述基因插入到一种表达载体而获得的，并且所述基因的核苷酸序列与所述重组表达载体的表达控制序列可操作地连接；优选地，所述表达载体是pCAMBIA2300；优选地，所述重组表达载体为图2所示的35S-AmCMO-2300载体。本专利技术第三方面提供一种重组细胞，其含有本专利技术第一方面所述的基因或者本专利技术第二方面所述的重组表达载体；优选地，所述重组细胞为重组农杆菌细胞。本专利技术第四方面提供一种改善植物耐盐性和/或耐旱性的方法，包括：将本专利技术第一方面所述基因或者本专利技术第二方面所述的重组表达载体导入植物或植物组织并使所述基因表达；优选地，所述植物是拟南芥。本专利技术第五方面提供一种制备转基因植物的方法，包括：在有效产生植物的条件下培养含有本专利技术第一方面所述基因或者本专利技术第二方面所述的重组表达载体的植物或植物组织；优选地，所述植物是拟南芥。本专利技术第六方面提供本专利技术第一方面所述的基因、本专利技术第二方面所述的重组表达载体或者本专利技术第三方面所述的重组细胞用于改善植物耐盐性和/或耐旱性以及用于植物育种的用途；优选地，所述植物是拟南芥。本专利技术第七方面提供由本专利技术第一方面所述的基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。.附图说明图1是AmCMO基因的植物表达载体(35S-AmCMO-2300)构建流程(图1a-1b)。图2是AmCMO基因的植物表达载体(35S-AmCMO-2300)的质粒图。图3是转AmCMO基因的T1代拟南芥植株的耐盐实验结果，T1l3表现出显著的耐盐性，T1l17、T1l19的结果与其类似，在此未示出。图4为利用反转录PCR对T1代转基因拟南芥植株和非转基因对照植株中AmCMO基因的转录水平进行分子水平检测的结果。M为DNALadderMarker(DL2000)，1-8为耐盐T1代转基因拟南芥植株(分别属于T1l3、T1l17、T1l19三个株系)，9-12为非转基因对照拟南芥植株。图5是转AmCMO基因的T1代拟南芥植株的耐旱实验结果，T1l3表现出显著的耐旱性，T1l17、T1l19的结果与其类似，在此未示出。具体实施方式提供以下实施例，以方便本领域技术人员更好地理解本专利技术。所述实施例仅出于示例性目的，并非意在限制本专利技术的范围。以下实施例中提到的未注明来源的限制性内切酶均购自NewEnglandBiolabs公司。在本专利技术中，如果没有注明并且在上下文中没有歧义，比例和百分比是基于重量计算的。实施例1.盐胁迫下白骨壤SSH文库构建：具体方法为：按照Clontech公司的PCR-selectTMcDNASubtractionKit试剂盒说明书所示的方法通过抑制差减杂交方法构建SSH文库(抑制差减文库)。在实验过程中以盐处理的白骨壤根中提取的mRNA作为样本(Tester)，以未处理的白骨壤根中提取的mRNA作为对照(Driver)。具体步骤如下：(1)供试材料：白骨壤采自广东省深圳市福田国家级自然保护区(N22°53′，E114°01′)。采集无虫害、发育良好、成熟程度接近的白骨壤(Aricenniamar本文档来自技高网...

【技术保护点】
PCT国内申请，权利要求书已公开。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种编码白骨壤的单加氧酶的基因编码的蛋白，其序列为SEQIDNO：1。2.编码权利要求1所述的蛋白的基因，其序列为SEQIDNO：2。3.一种重组表达载体，其是通过将权利要求2所述的基因插入到一种表达载体而获得的，并且所述基因的核苷酸序列与所述表达载体的表达控制序列可操作地连接。4.权利要求3的重组表达载体，其中所述表达载体是pCAMBIA2300。5.权利要求3或4所述的重组表达载体，其为图2所示的35S-AmCMO-2300载体。6.一种重组农杆菌细胞，其含有权利要求2所述的基因或者权利要求3-5中任一项所述的重组表达载体。7....

【专利技术属性】
技术研发人员：王建胜，何云蔚，田大翠，梁丽，
申请(专利权)人：创世纪种业有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44