本发明专利技术公开了一种人血型A抗原或B抗原基因重组蛋白及其制备方法和应用。属于生物医药领域。A/B抗原重组蛋白的制备方法，包括如下步骤：a)A/B抗原的DNA片段克隆及表达载体的构建；b)A/B抗原基因重组蛋白的表达；c)A/B抗原基因重组蛋白的纯化。本发明专利技术制备的A/B重组抗原，具有稳定、灵敏等优点，突破了血型检测的条件限制，为临床急救与血液普查提供了新的思路与技术。
【技术实现步骤摘要】
一种人血型A抗原或B抗原基因重组蛋白及其制备方法和应用
本专利技术属于生物医药领域，具体的涉及一种人血型A抗原或B抗原基因重组蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
ABO血型系统的检测在临床输血、器官移植、新生儿溶血检测等方面有重要意义，同时在人种学、遗传学、法医学、疾病抵抗力(或易感性)等方面都有应用价值。在输血前，一定要检查病人(受血者)和输血人(供血者)的血型，并且要进行交叉配血试验。为了保证正确的血型鉴定，卫生部在2000年发文(卫医法[2000]184号)明确规定：每位供血及受血的个体均要进行ABO血型正反定型。人类ABO基因位于染色体9q34.1-34.2，ABO基因包含长度大小从28-688bp不等的7个外显子和长度约为19514bp的6个内含子，其中第6和第7外显子包括了77％的基因编码序列，同时也包括了91％的糖基转移酶催化区域序列。ABO基因的调控区域大约总长为18-20kb，产物是糖基转移酶，这些酶控制ABO血型抗原的生物合成。A和B等位基因编码一个长为354个氨基酸的蛋白质，ABO抗原的化学结构是糖蛋白，其血清学特异性取决于糖链末端3个糖基的结构，形成红细胞上不同的A、B凝集原，将血型分为O、A、B及AB血型。A型血红细胞上含A抗原，血清中含抗B抗体；B型血红细胞上含B抗原，血清中含抗A抗体；O型血红细胞上则没有A及B抗原，血清中含抗A及抗B抗体；AB型血红细胞上含A及B两种抗原，血清中则不含抗A及抗B抗体。A抗原和抗A抗体，B抗原和抗B抗体会发生免疫结合反应，使红细胞发生凝聚。目前，ABO血型试验检测方法已经成熟的试验方法有血凝试验、微柱凝集试验、基因检测等方法。其中正反定型的血凝试验中用到的标准A型、B型和O型红细胞与抗A、抗B抗体，存在保存期短，保存条件较苛刻(2～8℃，避光)，且容易发生微生物污染及溶血现象等问题，这些问题容易导致血型鉴定出差错，甚至出现严重输血事故。微柱凝胶法检测时则需要特制的凝胶卡，同时需配备专用离心机，检测成本较高。除以上两种常用的方法之外，还有磁珠法。磁珠法在使用前，需进行试剂的复溶，复溶后的试剂存放时间较短，一般7天内必须使用完，而且需要专门的磁化程控振荡器。而急救、血型普查、陈旧血液样本的检测等对血型的检测提出了更高的检验要求。所以开发更为准确、快速、简便的血型检测方法，突破传统的血型检测弊端，是亟待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术中的问题，提供一种A抗原基因重组蛋白和B抗原基因重组蛋白。本专利技术的另一目的是提供一种A抗原基因重组蛋白和B抗原基因重组蛋白的制备方法。本专利技术采用的技术方案是：一种人血型A抗原或B抗原基因重组蛋白，所述的人血型A抗原基因重组蛋白的DNA序列如SEQIDNO.1所示；所述的人血型B抗原基因重组蛋白的DNA序列如SEQIDNO.2所示。上述的人血型A抗原或B抗原基因重组蛋白的制备方法，方法如下：1)提取人全血中的总DNA；2)以DNA为模板，通过设计的特异性引物，利用PCR方法扩增，分别得到A抗原PCR扩增产物或B抗原PCR扩增产物；其中，所述的特异性引物是：上游引物PA1：5'-ATGGAGCCCCCGGACGCACC-3'；下游引物PA2：5'-AGTCGTGAGCAGAGGCTTCG-3'；上游引物PB1：5'-ATGGAGCCCCCGGACGCACC-3'；下游引物PB2：5'-AGTCGTGAGCAGAGGCTTCG-3'；PCR反应体系为：20μL体系：Mg2+1.5mmol/L，dNTP0.2mmol/L，Taq酶1U，引物各5pmol/L，样品DNA100～200ng，超纯水余量；PCR反应程序为：95℃10min；94℃20s，63℃30s，72℃lmin，进行10个循环；94℃20s，60℃30s，72℃1min，进行25个循环；72℃延伸5min；4℃保存。3)将得到的A抗原PCR扩增产物和B抗原PCR扩增产物分别与质粒pMD18-T进行T克隆，得到重组质粒PMD18-T/A和PMD18-T/B；4)将重组质粒PMD18-T/A及重组质粒PMD18-T/B分别和表达载体pUCm-4T-1同时进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，连接，分别制得重组表达载体pUCm-4T-1/A及pUCm-4T-1/B；5)将重组表达载体pUCm-4T-1/A或pUCm-4T-1/B分别转化到Ecoli.BL21表达宿主菌中，筛选阳性表达菌株；6)将筛选的含重组表达载体pUCm-4T-1/A的阳性表达菌株或含重组表达载体pUCm-4T-1/B的阳性表达菌株，经诱导表达，纯化后，得到A抗原基因重组蛋白或B抗原基因重组蛋白。所述的诱导表达是：将筛选的含重组表达载体pUCm-4T-1/A的阳性表达菌株或含重组表达载体pUCm-4T-1/B的阳性表达菌株，接种于LB培养基中，37℃过夜培养，次日按1:100扩大培养至菌液OD600nm＝0.6时，于菌液中加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，37℃诱导12h。所述的纯化是：将诱导表达后的菌液，以12000r/min离心10min，富集菌体，菌体用20mmol/LpH为8.0的Tris-HCl缓冲液，按1:10的体积比，重悬菌体，冰浴超声破碎至菌悬液澄清，4℃，12000r/min离心10min，收集上清液，上清液中加入SDSloadingbuffer，取沉淀物，沉淀物用尿素溶解，8000r/min离心10min，收集上清液，上清液再加入SDSloadingbuffer，煮沸10min，10000r/min离心10min，得纯化的A抗原基因重组蛋白或B抗原基因重组蛋白。本专利技术的有益效果为：1.本专利技术，成功构建了重组表达载体pUCm-4T-1/A及pUCm-4T-1/B，并能在大肠杆菌中表达A抗原基因重组蛋白及B抗原基因重组蛋白；重组蛋白能与A抗体、B抗体血清进行反应，具有良好的反应原性，可用于血型的检测，具有制备成本低的优点。2.将本专利技术制备的A抗原基因重组蛋白及B抗原基因重组蛋白应用于胶体金等，可以制备血型检测试纸，进行更为准确、快速、简便的血型检测，突破了传统的血型检测的弊端，可成为一种新的血型检测方法。满足急救、血型普查、陈旧血液样本的检测等对血型的检测提出的更高的检验要求。附图说明图1为本专利技术A基因与B基因的RT-PCR产物鉴定图。图2为本专利技术PMD18-T/A与PMD18-T/B质粒的PCR鉴定图。图3为本专利技术PMD18-T/A与PMD18-T/B质粒的酶切图。图4为本专利技术pUCm-4T-1/A与pUCm-4T-1/B质粒的PCR鉴定图。图5为本专利技术pUCm-4T-1/A和pUCm-4T-1/B质粒的酶切鉴定图。具体实施方式Trizolplus，PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒，PrimeSTARPCRMix，DL2000Marker、DL5000Marker，ligationmix连接试剂盒，BamHI、XhoI限制性内切酶，IPTG等试剂购于宝生物工程(大连)有限公司。质粒抽提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒等购自OMEGA。实施例1人血型A抗原基因重组蛋白(一)提取人全血中的总DNA收集4例中国汉族无偿捐血者，根据血库操作规程，采集本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人血型A抗原或B抗原基因重组蛋白，其特征在于，所述的人血型A抗原基因重组蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；所述的人血型B抗原基因重组蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种人血型A抗原或B抗原基因重组蛋白，其特征在于，所述的人血型A抗原基因重组蛋白的DNA序列如SEQIDNO.1所示；所述的人血型B抗原基因重组蛋白的DNA序列如SEQIDNO.2所示。2.权利要求1所述的人血型A抗原或B抗原基因重组蛋白的制备方法，其特征在于，方法如下：1)提取人全血中的总DNA；2)以DNA为模板，通过设计的特异性引物，利用PCR方法扩增，分别得到A抗原PCR扩增产物或B抗原PCR扩增产物；其中，所述的特异性引物是：上游引物PA1：5'-ATGGAGCCCCCGGACGCACC-3'；下游引物PA2：5'-AGTCGTGAGCAGAGGCTTCG-3'；上游引物PB1：5'-ATGGAGCCCCCGGACGCACC-3'；下游引物PB2：5'-AGTCGTGAGCAGAGGCTTCG-3'；3)将得到的A抗原PCR扩增产物和B抗原PCR扩增产物分别与质粒pMD18-T进行T克隆，得到重组质粒pMD18-T/A和pMD18-T/B；4)将重组质粒pMD18-T/A及pMD18-T/B分别和表达载体pUCm-4T-1同时进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，连接，分别制得重组表达载体pUCm-4T-1/A或pUCm-4T-1/B；5)将重组表达载体pUCm-4T-1/A或pUCm-4T-1/B分别转化到Ecoli.BL21表达宿主菌中，筛选阳性表达菌株；6)将筛选的含重组表达载体pUCm-4T-1/A的阳性表达菌株或含重组表达载体pUCm-4T-1/B的阳性表达菌株，经诱导表达，纯化后，得到A抗原基因重组蛋白或B抗原基因重组蛋白。3.根据权利要求2所述的人血型A抗原或B抗原基因重组蛋白的制备方法，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：康慧颖，赵洪礼，海洋，张鹏，孙雪薇，魏冉，杨振，王昆，何伟，
申请(专利权)人：何伟，
类型：发明
国别省市：辽宁,21
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