一种表达质粒、用于包装二代腺病毒的细胞株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种表达质粒、一种用于包装二代腺病毒的细胞株及其应用。本发明专利技术的细胞株于2019年05月08日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2019111，分类命名是人胚肾转化细胞AY293‑6015。本发明专利技术的细胞株包含腺病毒的E4‑ORF6/7基因，能够用于包装E4基因缺失的二代腺病毒而形成完整的具有感染性的二代腺病毒颗粒。本发明专利技术的真核质粒以RSV启动子代替病毒载体中常用的CMV启动子，减少了病毒细胞包装中同源重组的发生几率，降低了RCA的形成。

【技术实现步骤摘要】
一种表达质粒、用于包装二代腺病毒的细胞株及其应用
本专利技术属于基因治疗和重组疫苗领域，具体涉及一种表达质粒、一种用于包装二代腺病毒的细胞株及其应用。
技术介绍
近年来，病毒载体的应用颇受多方学者关注，其中，腺病毒载体因其对细胞周期的要求低而具有转基因效率高，宿主范围广，病毒滴度高，又不整合到宿主基因组中，安全性高的优点，在基因治疗和大分子医药方面有越来越多的应用和价值的体现，为当前非常有应用前景的病毒载体。腺病毒基因组含有4个早期转录元，分别为E1(E1a和E1b)、E2(E2a和E2b)、E3和E4，编码病毒的调节蛋白，以及5个晚期转录元L1～L5，编码晚期表达的病毒结构蛋白。腺病毒的基因组约为36000bp，整个基因组被分为100个基因图距单位，基因组的5＇端和3＇端各有长100-150bp的反向末端重复序列(ITR)，在其左端ITR3＇端为长约300bp的包装信号Ψ，ITR及包装信号Ψ是腺病毒基因组复制和包装不可缺少的顺式作用元件，其长度不到1kb，除此以外的病毒基因组都可以被置换，其功能可用反式作用提供补偿。要在腺病毒中插入外源基因，必须缺失一段腺病毒基因组，缺失位点一般有E1、E3及E4与末端反向重复序列(ITR)之前的区域。现有的腺病毒载体根据包装容量可分为三代。第一代腺病毒载体为缺失E1、E3区，外源基因片段最多可插入6kb。第二代腺病毒载体为缺失E1、E3的基础上将E2a突变或者缺失E4，最大包装容量为9kb。第三代腺病毒载体为辅助依赖型腺病毒载体，其缺失所有的编码序列，只含有两端的ITR和包装信号Ψ，插入外源基因可达36kb。这些腺病毒载体由于病毒基因组内非必需区域缺失，插入外源基因后，必须由反式作用提供补偿。反式补偿方式有两种，一种是由辅助病毒提供反式补偿，即辅助病毒依赖型，腺病毒基因片段可缺失相当一部分；另一种是由辅助包装细胞提供反式补偿，即由互补的细胞系提供反式补偿，比如第一代腺病毒载体需要293细胞系、911细胞系以及PERC6细胞系等，这些细胞系可以反式提供E1区的蛋白功能，使E1区缺失的腺病毒载体增殖并产生成熟的腺病毒颗粒。第一代腺病毒载体由于具有病毒滴度高、感染效率高、制备简单等优点，使其在基因治疗领域备受青睐，但是，第一代腺病毒载体与表达E1蛋白的293细胞之间存在同源序列，通过重组，可重新获得E1区，导致产生可复制的腺病毒(RCA，replication-competentadenovirus)，由于RCA具有复制能力，在腺病毒的包装过程中一旦出现，就可能呈现优势生长，它不但影响载体病毒的产量，也为腺病毒噬菌斑的筛选纯化带来困难。另一方面，研究发现当以较高的MOI(感染复数，病毒/细胞MultiplyOfInfection)感染细胞时，E2区对E1区功能上的依赖可以被忽略，病毒仍可以复制并表达晚期基因。另外，第一代非增殖型腺病毒载体最多只能装载约6kb的外源基因，这对于许多基因治疗方案来说仍是远远不够的。因此，第二代腺病毒载体的应用尤为重要，其引起的宿主抗病毒免疫反应与第一代相比较要弱很多，因此在靶细胞中更稳定，目的基因的表达的时间也更长。同第一代腺病毒载体一样，第二代腺病毒载体的包装依赖于辅助细胞(或)病毒提供其所缺失的反式作用元件，研发一种能够大规模生产第二代腺病毒载体的特异性细胞系是目前增强第二代腺病毒载体临床应用水平的理想解决方案。
技术实现思路
研究表明腺病毒E4的产物对于高效的病毒感染至关重要，本专利技术小组发现，E4的几种开放阅读框(ORF)如ORF3和ORF6以及ORF6/7是成功包装腺病毒所必须的，本专利技术通过构建RSV启动表达的ORF6/7制备了一种表达质粒以及一种用于包装第二代腺病毒载体的细胞株，该细胞株中包含腺病毒基因组E4的ORF6/7，能够为缺失E4的二代腺病毒提供反式补偿。作为本专利技术的第一方面，本专利技术提供了一种表达质粒。作为优选，所述表达质粒包括腺病毒E4-ORF6/7基因的核酸序列。作为优选，所述表达质粒是通过将腺病毒E4-ORF6/7基因序列插入真核表达载体的多克隆位点制备而成，所述E4-ORF6/7基因序列如SEQIDNo.3。作为优选，所述真核表达载体为pcDNA3.1。作为优选，所述表达质粒以RSV启动蛋白表达。作为优选，所述表达质粒的碱基序列如SEQIDNo.5所示。作为本专利技术的第二方面，本专利技术提供了包含上述表达质粒的细胞株。作为本专利技术的第三方面，本专利技术提供了上述表达质粒在用于制备能够包装二代腺病毒的细胞株中的应用。作为本专利技术的第四方面，本专利技术提供了一种用于包装二代腺病毒的细胞株，该细胞株中包含腺病毒E4基因的ORF6/7。作为优选，所述细胞株的保藏编号为：CCTCCNo:C2019111。作为优选，所述细胞株是通过将HEK293细胞经过基因工程改造所获得，该细胞株用于包装缺失E4基因的重组二代腺病毒载体。作为优选，所述细胞株的构建包括如下步骤：1)构建表达质粒，所述表达质粒包含编码腺病毒E4-ORF6/7蛋白的核酸序列；2)以步骤1)所获得的表达质粒转染HEK293细胞，筛选获得表达E4-ORF6/7蛋白的阳性细胞株；3)用缺失E4基因的二代腺病毒转染步骤2)所得的阳性细胞株，筛选获得用于包装所述缺失E4基因的重组二代腺病毒载体的细胞株。作为优选，所述步骤1)中的表达质粒是通过将腺病毒E4-ORF6/7基因序列插入真核表达载体的多克隆位点制备而成，所述E4-ORF6/7基因序列如SEQIDNo.3。作为优选，所述真核表达载体为pcDNA3.1。作为优选，所述表达质粒以RSV启动蛋白表达。作为本专利技术的第五方面，本专利技术提供了上述的细胞株在用于包装二代腺病毒中的应用。作为本专利技术的第六方面，本专利技术提供一种制备用于包装二代腺病毒的细胞株的方法。作为优选，所述方法包括如下步骤：1)构建表达质粒，所述表达质粒包含编码腺病毒E4-ORF6/7蛋白的核酸序列；2)以步骤1)所获得的表达质粒转染表达腺病毒E1蛋白的包装细胞株，筛选获得表达E4-ORF6/7蛋白的阳性细胞株；3)用缺失E4基因的二代腺病毒转染步骤2)所得的阳性细胞株，筛选获得用于包装所述缺失E4基因的二代腺病毒的细胞株。作为优选，所述步骤1)中的表达质粒是通过将腺病毒E4-ORF6/7基因序列插入真核表达载体的多克隆位点制备而成，所述E4-ORF6/7基因序列如SEQIDNo.3。作为优选，所述真核表达载体为pcDNA3.1。作为优选，所述表达质粒以RSV启动蛋白表达。作为优选，所述步骤2)中的表达腺病毒E1蛋白的包装细胞株为293细胞系、911细胞系或PERC6细胞系。有益效果：(1)本专利技术采用DNA转染的方式将腺病毒hAd5-E4-ORF6/7基因运输到真核表达载体制备了一种包含E4-ORF6/7基因的表达质粒，以及利用该表达质粒转染HEK293细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达质粒，其特征在于，所述表达质粒包括腺病毒E4-ORF6/7基因的核酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种表达质粒，其特征在于，所述表达质粒包括腺病毒E4-ORF6/7基因的核酸序列。


2.根据权利要求1所述的表达质粒，其特征在于，所述表达质粒是通过将腺病毒E4-ORF6/7基因序列插入真核表达载体的多克隆位点制备而成，所述E4-ORF6/7基因序列如SEQIDNo.3。


3.根据权利要求2所述的表达质粒，其特征在于，所述真核表达载体为pcDNA3.1。


4.根据权利要求1所述的表达质粒，其特征在于，所述表达质粒以RSV启动蛋白表达。


5.根据权利要求1所述的表达质粒，其特征在于，所述表达质粒的碱基序列如SEQIDNo.5所示。


6.一种包含如权利要求1～5任一项所述的表达质粒的细胞株。


7.一种用于包装二代腺病毒的细胞株，其特征在于，所述细胞株的保藏编号为：CCTCCNo:C2019111。


8.根据权利要求7所述的细胞株，其特征在于，所述细胞株是通过将HEK293细胞经过基因工程改造所获得，该细胞株用于包装缺失E4基因的二代重组腺病毒载体。


9....

【专利技术属性】
技术研发人员：陈平，李娜，王暄，杨文清，李楠，
申请(专利权)人：嘉铭固安生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河北;13