用于纯化体外产生的病毒的方法及对于病毒的清除测定技术

本文提供了一种使用具有至少一种去垢剂的组合物纯化体外产生的无包膜病毒或假包膜病毒(pseudo‑enveloped virus)的方法。还提供了一种可使用多种去垢剂的纯化方法，以及一种确定样品中无包膜病毒或假包膜病毒的存在或水平的方法。

Method for purifying virus produced in vitro and determination of virus clearance

This paper provides a composition having at least one detergent purified in vitro generated non enveloped virus or false envelope virus (pseudo enveloped virus) method. Also provides a variety of detergents can be used as a purification method, determine the presence or level of non enveloped virus or false envelope virus samples method.

【技术实现步骤摘要】
描述优先权和相关申请的交叉引用本申请要求于2015年7月23日提交的美国临时申请62/196,004的优先权的权益，其在此通过引用以其整体明确并入。序列表的引用本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表作为命名为DURC6_007AUS_SEQLIST.txt的文件提供，该序列表大小为1,081字节，创建日期为2016年5月31日且最后修改日期为2016年5月31日。该电子格式的序列表中的信息通过引用以其整体并入本文。背景领域本专利技术涉及病毒学领域，更确切地，涉及纯化在细胞培养物中繁殖的及用于在病毒清除研究中使用的无包膜病毒或假包膜病毒诸如，戊型肝炎病毒(HEV)、甲型肝炎病毒(HAV)和猪细小病毒(PPV)的方法。相关技术描述所有的血液来源的产品和血浆来源的产品的临床使用携带感染性血源性病原体传播的潜在风险。风险的缓解可通过在血液来源的产品和血浆来源的产品的制造过程中实施病原体减少步骤来实现。为了开发和证明此类病原体减少步骤的效力，进行了病毒清除研究。在这些研究期间，已知量的病毒被掺入血液或血浆产品的中间体中，然后被掺入的样品使用实验室规模模式(按比例缩小的模式)的包括病原体减少步骤的制造过程来处理。在病原体减少步骤期间的病毒减少和/或清除通过比较在该步骤之前和之后的病毒的量来确定。为了保证病毒清除数据的有效性，按比例缩小的模式必须准确地代表大规模单元操作，且病毒掺入物(virusspike)应该代表潜在的污染物。例如，病毒掺入物在体外的培养可能需要血清，且病毒掺入物中血清的存在可影响牵涉无血清产物中间体的清除研究。非病毒污染物，诸如外来宿主细胞膜、蛋白和核酸的存在也可能干扰下游步骤(其中产物中间体假定被高度纯化)期间病毒清除的准确评估。因此，去除可影响按比例缩小的模式的性能和相关性的病毒掺入物污染物是重要的。概述在一些实施方案中，本专利技术包括基于用去垢剂处理包含无包膜病毒或假包膜病毒的样品的方法，纯化在细胞培养物中繁殖的无包膜或假包膜病毒的方法。在该方法的一些实施方案中，在细胞培养物中繁殖的病毒是甲型肝炎病毒(HAV)。在该方法的一些实施方案中，在细胞培养物中繁殖的病毒是猪细小病毒(PPV)。在该方法的一些优选实施方案中，在细胞培养物中繁殖的病毒是戊型肝炎病毒(HEV)。在该方法的一些实施方案中，病毒在体外细胞培养物中产生。在该方法的一些实施方案中，体外细胞培养物包括建立的细胞系。在该方法的一些实施方案中，建立的细胞系选自由HepG2(ATCC号HB-8065)和HepG2/C3A(ATCC号CRL-10741)组成的组。在该方法的一些实施方案中，去垢剂选自由十二烷基硫酸锂、TritonX-100及其混合物组成的组。在该方法的一些实施方案中，TritonX-100的浓度为0.5％且十二烷基硫酸锂的浓度为0.1％。在该方法的一些实施方案中，处理的步骤进行1小时。在该方法的一些实施方案中，样品是从澄清的病毒感染的细胞裂解物悬液的超速离心获得的上清液。在该方法的一些实施方案中，任选地，样品是来源于澄清的病毒感染的细胞裂解物悬液的横向流过滤(transflowfiltration)的滞留物。提供了一种测量样品中无包膜病毒或假包膜病毒的水平的方法，该方法包括以下的步骤：a)向包含细胞系和培养基的混合物提供样品；b)孵育以允许该无包膜病毒或假包膜病毒的繁殖以获得孵育的部分，如果该无包膜病毒或假包膜病毒存在于样品中的话；c)用至少一种去垢剂处理以获得处理的部分；d)收集所处理的部分的一部分以获得收集的部分；以及e)测量所收集的部分中该无包膜病毒或假包膜病毒的水平。在该方法的一些实施方案中，样品从哺乳动物中获得。在该方法的一些实施方案中，样品包括血浆或血液。在该方法的一些实施方案中，该无包膜病毒或假包膜病毒是HAV。在该方法的一些实施方案中，该无包膜病毒或假包膜病毒是PPV。在该方法的一些优选的实施方案中，该无包膜病毒或假包膜病毒是HEV。在该方法的一些实施方案中，病毒在包含建立的细胞系的体外细胞培养物中繁殖。在该方法的一些实施方案中，细胞系选自由HepG2(ATCC号HB-8065)和HepG2/C3A(ATCC号CRL-10741)组成的组。在该方法的一些实施方案中，样品包括由通过膜横向流过滤所孵育的部分的一部分获得的第一滞留物。在该方法的一些实施方案中，任选地，样品包括由通过膜横向流过滤所孵育的部分的一部分以获得第一滞留物并离心该第一滞留物获得的第一上清液。在该方法的一些实施方案中，样品用至少一种去垢剂或任选地去垢剂的混合物来处理以获得第一溶液，该方法还包括：a)提供通过离心第一溶液获得的第一沉淀(pellet)；b)提供通过将该第一沉淀重悬于PBS(磷酸盐缓冲盐水)中获得的第二溶液；c)提供通过将第二溶液澄清获得的第三溶液；d)提供通过使用膜过滤第三溶液获得的第一滤液；以及e)提供通过超滤第一滤液获得的第二滞留物，其中该第二滞留物包含所处理的部分。在该方法的一些实施方案中，测量无包膜病毒或假包膜病毒的水平包括检测生物物质，其中该生物物质包括病毒的多核苷酸序列和/或多肽序列，并且其中该生物物质是HEV核糖核酸。在该方法的一些实施方案中，测量生物物质包括：a)提供通过将所处理的部分的一部分与裂解溶液混合获得的包含HEV核糖核酸的第一反应混合物；b)提供通过将第一试剂添加至第一反应混合物获得的第二反应混合物，其中该第二反应混合物包含与HEV核糖核酸互补的脱氧核糖核酸；c)将第二试剂添加至第二反应混合物，该第二试剂至少部分地与在该脱氧核糖核酸内的序列互补；d)将第三试剂添加至第二反应混合物，该第三试剂至少部分地与在该脱氧核糖核酸内的序列互补；e)扩增在该脱氧核糖核酸内被第二试剂和第三试剂包含的序列；以及f)测量所扩增的序列的浓度。在该方法的一些实施方案中，第二试剂和第三试剂包含选自由以下组成的组的寡核苷酸序列：a)5’-CGGCTATCGGCCAGAAGTT-3’(SEQIDNO:1)；b)5’-CCGTGGCTATAACTGTGGTCT-3’(SEQIDNO:2)以及c)5’-FAM-TTTTTACGC-ZEN-AGGCTGCCAAGGCC-3IABkFQ-3’(SEQIDNO:3)。在一些实施方案中，本专利技术包括一种基于用至少一种阴离子去垢剂诸如十二烷基硫酸锂(LDS)、或至少一种非离子去垢剂诸如TritonX-100或两者的组合处理包含无包膜病毒或假包膜病毒的样品的方法，纯化在细胞培养物中繁殖的无包膜病毒或假包膜病毒的方法，允许获得在清除研究中其表现与可能潜在地存在于高度纯化的工艺流中的那些病毒的表现大概相同或接近相同的病毒。在一些实施方案中，通过该方法的以上描述的一些实施方案产生的病毒将是在血液来源的蛋白和/或血浆来源的蛋白的制造过程中测试下游步骤的病毒减少和/或清除能力的合适的掺入物。在一些实施方案中，基于一种处理方法纯化在细胞培养物中产生的病毒的方法包括：澄清病毒感染的材料；通过膜横向流过滤混合物的至少一部分，以获得第一滞留物；以及离心该第一滞留物以获得第一上清液。该处理方法包括：用至少一种去垢剂处理第一上清液以获得第一溶液；其中该方法还包括：在所述处理之后，离心该第一溶液以获得本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纯化在细胞培养物中繁殖的无包膜病毒或假包膜病毒的方法，所述方法包括用去垢剂处理包含所述无包膜病毒或所述假包膜病毒的样品的步骤。

【技术特征摘要】
2015.07.23 US 62/196,0041.一种纯化在细胞培养物中繁殖的无包膜病毒或假包膜病毒的方法，所述方法包括用去垢剂处理包含所述无包膜病毒或所述假包膜病毒的样品的步骤。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述在细胞培养物中繁殖的病毒是戊型肝炎病毒(HEV)。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述在细胞培养物中繁殖的病毒是甲型肝炎病毒(HAV)或猪细小病毒(PPV)。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒在体外细胞培养物中产生。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述体外细胞培养物包含建立的细胞系。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述建立的细胞系选自由HepG2(ATCC号HB-8065)和HepG2/C3A(ATCC号CRL-10741)组成的组。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述去垢剂选自由十二烷基硫酸锂、TritonX-100及其混合物组成的组。8.根据权利要求7所述的方法，其中TritonX-100的浓度为0.5％且十二烷基硫酸锂的浓度为0.1％。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述处理的步骤进行1小时。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是从澄清的病毒感染的细胞裂解物悬液的超速离心获得的上清液。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是来源于澄清的病毒感染的细胞裂解物悬液的横向流过滤的滞留物。12.一种测量样品中无包膜病毒或假包膜病毒的水平的方法，所述方法包括以下的步骤：a)向包含细胞系和培养基的混合物提供所述样品；b)孵育以允许所述无包膜病毒或所述假包膜病毒的繁殖以获得孵育的部分，如果所述无包膜病毒或所述假包膜病毒存在于所述样品中；c)用至少一种去垢剂处理以获得处理的部分；d)收集所处理的部分的一部分以获得收集的部分；以及e)测量所收集的部分中所述无包膜病毒或所述假包膜病毒的水平。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述样品从哺乳动物获得。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述样品包括血浆或血液。15.根据权利要求12所述的方法，其中所述无包膜病毒或所述假包膜病毒是HEV。16.根据权利要求12所述的方法，其中所述无包膜病毒或所述假包膜病毒是HAV或PPV。17.根据权利要求12所述的方法，其中所述病毒在包含建立的细胞系的体外细胞培养物中繁殖。18.根据权利要求12所述的方法，其中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：布雷特·布诺，特里·乔尼根，约安·霍塔，迈克尔·伯迪克，
申请(专利权)人：基立福有限公司，
类型：发明
国别省市：西班牙;ES