本发明专利技术提供一种12种猪常见病毒及细菌免疫磁珠纯化试剂盒及方法。所述试剂盒包括试剂A、试剂B和试剂C，试剂A为链霉素磁珠悬液，试剂B为12种生物素化的单克隆抗体混合液，试剂C为10×免疫磁珠分离纯化体系缓冲液。所述方法步骤包括：(1)病原悬液的准备过程；(2)生物素抗体制备过程；(3)病原的免疫纯化过程。本发明专利技术提供的12种猪常见病毒及细菌免疫磁珠纯化试剂盒及方法，可同时、快速、有效地纯化样品中的猪细小病毒(PPV)、猪链球菌II型(SS-II)、猪伪狂犬病毒(PRV)等12种病毒及细菌。所述检测方法准确性、特异性和敏感性高，稳定性好，有利于后续的快速诊断和有效检测工作。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉细菌及病毒的生物技术检测领域，特别是涉及一种采用免疫磁珠同时分离纯化12种猪常见病毒及细菌的试剂盒及方法。
技术介绍
我国是农业畜牧业大国，猪类养殖以规模化集约化养殖为主，高密度的养殖方式也使得猪类的传染性疾病难以预防，且问题日益显著。而且多种病原同时感染，导致诊断及预防疾病发生也十分困难。猪类常见的传染性疾病病原有猪细小病毒(Porcineparvovirus，PPV)、猪链球菌II型(Streptococcussuistype2，SS-II)、猪伪狂犬病毒(Porcinepseudorabiesvirus，PRV)、猪圆环II型病毒(Porcinecircovirus-2，PCV-2)、传染性胃肠炎病毒(Transmissiblegastroenteritisvirus，TEGV)、流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)、轮状病毒(Porcinerotavirus，PRTV)、猪流感病毒(SwineInfluenzavirus，SIV)、猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus，CSFV)、猪口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdiseasevirus，FMDV)、猪蓝耳病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)、高致病猪蓝耳病毒株(Highpathogenicporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，Hp-PRRSV)等。目前对猪细菌的分离纯化方法主要是采用挑菌、接种培养基平板的方法，该方法不仅费时，而且漏检率高。病毒的分离纯化方法主要是使用细胞培养的方法，该方法对操作人员要求较高，且对实验室环境及实验设备要求较高，且周期较长。免疫磁珠分离技术(Immunomagneticbead-basedseparation)是近年来发展起来的一项新的免疫学技术，可以有效捕获样品中的病原，去除复杂样本中的抑制物，减少培养时间，富集大量样本中的靶目标。本专利技术免疫磁珠是以免疫学为基础，将链霉素磁珠偶联生物素化的多种单克隆抗体，利用特异性的免疫学反应，在磁力作用下，发生力学移动，从混合溶液中分离纯化病原。免疫磁珠具有特异性好，敏感度高的特点，提高了分离纯化的准确率，减少假阳性的出现。目前已有相关的研究针对不同病原菌或病毒利用免疫磁珠进行分离纯化。例如，申请号为CN201110349281.8公开了腐败希瓦氏菌的免疫磁珠-FQ-PCR检测方法，它采用免疫磁珠对腐败希瓦氏菌进行富集，并进行FQ-PCR检测。申请号为CN200810198009.2公开了一种轮状病毒实时荧光PCR检测试剂盒。申请号为CN201210062791.1公开了一种副溶血性弧菌检测试剂盒及其检测方法。申请号为CN201410182398.5公开了一种空肠弯曲杆菌和沙门氏菌的磁捕获-双重实时荧光PCR检测方法。但对于使用免疫磁珠对多种病毒及细菌进行免疫纯化分离的研究较少，对于生物素化链霉素磁珠的分离纯化条件没有进行详细的研究。本专利技术利用免疫反应、生物素-链霉素偶联及磁场动力效应，对12种猪常见病毒及细菌的进行分离纯化，可提高病原的富集浓度及检测灵敏度。同时通过该方法的操作简单，稳定性好，耗时少的特点，可减少病原检测时间。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种12种猪常见病毒及细菌免疫磁珠纯化试剂盒及方法，准确性、特异性和敏感性高，稳定性好，能够对12种病原进行快速分离纯化。具体的针对上述目的，本专利技术提供的技术方案如下：(1)免疫磁珠的制备。进一步的，所述步骤(1)具体包括以下步骤：1)将12种单克隆抗体进行生物素化标记；2)将步骤1)的12种生物素化的单克隆抗体偶联链霉素磁珠(StreptavidinParticlesPlus-DM)；3)制备含有生物素化单克隆抗体包被的链霉素磁珠的反应体系；进一步的，步骤1)中单克隆抗体终浓度为480ng/ml。进一步的，步骤2)链霉素磁珠终浓度为20μg/ml，室温下孵育30min。进一步的，步骤2)链霉素磁珠需要使用3ml3％牛血清蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH＝7.4)洗涤磁珠3次备用。进一步的，步骤3)单克隆抗体-磁珠复合物需在磁力作用下6-8min并弃去上清。进一步的，步骤3)的洗涤过程需要使用3ml3％牛血清蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH＝7.4)洗涤磁珠3次。(2)制备待测样品：将待检样品离心，弃上清，重悬于3ml3％牛血清蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液(PBS)(pH＝7.4)缓冲液中。(3)目的细菌或病毒富集：进一步的，所述步骤(3)具体包括以下步骤：1)将3ml待检样品重悬液加入生物素化的单克隆抗体偶联链霉素磁珠反应体系中在室温下孵育30min，缓慢震荡。2)将流式细胞管置于磁力架6-8min，弃去上清。3)用3ml3％牛血清蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液PBS(pH＝7.4)洗涤磁珠3次，用磁力架辅助。4)将分离纯化后的悬液样品3000rpm离心10min，弃去上清。(4)纯化病毒或细菌的核酸提取按DNA/RNA共提取试剂盒(天根生化科技公司，货号DP422)说明书操作，分别提取猪圆环II型病毒(PCV-2)、猪伪狂犬病毒(PRV)及猪链球菌II型(SS-II)的基因组DNA及猪细小病毒(PPV)、传染性胃肠炎病毒(TEGV)、流行性腹泻病毒(PEDV)、轮状病毒(PRTV)、猪流感病毒(SIV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、高致病猪蓝耳病毒株(Hp-PRRSV)RNA，保存于-20℃备用。(5)荧光定量PCR检测进一步的，所述步骤(5)具体包括以下步骤：1)根据12种病原不同保守性特异序列设计并合成特异性引物：所述猪圆环II型的特异上游引物序列为SEQIDNO：1所示的核苷酸序列；所述猪圆环II型的特异下游引物序列为SEQIDNO：2所示的核苷酸序列；所述猪伪狂犬的特异上游引物序列为SEQIDNO：4所示的核苷酸序列；所述猪伪狂犬的特异下游引物序列为SEQIDNO：5所示的核苷酸序列；所述猪细小病毒的特异上游引物序列为SEQIDNO：7所示的核苷酸序列；所述猪细小病毒的特异下游引物序列为SEQIDNO：8所示的核苷酸序列；所述猪链球菌II型的特异上游引物序列为SEQIDNO：10所示的核苷酸序列；所述猪链球菌<本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种12种猪常见病毒及细菌免疫磁珠纯化试剂盒，其特征在于，包括试剂A、试剂B、试剂C。
【技术特征摘要】
1.一种12种猪常见病毒及细菌免疫磁珠纯化试剂盒，其特征在于，包括试剂A、试剂B、
试剂C。
2.根据权利要求1所述的12种猪常见病毒及细菌免疫磁珠纯化试剂盒，其特征在于，所述
试剂A的链霉素磁珠终浓度为20μg/ml。
3.根据权利要求1所述的12种猪常见病毒及细菌免疫磁珠纯化试剂盒，其特征在于，所述
试剂B为12种生物素化的单克隆抗体混合液，试剂B中的单克隆抗体终浓度为480ng/ml。
4.根据权利要求1所述的12种猪常见病毒及细菌...
【专利技术属性】
技术研发人员：王新杰，高姗姗，孙晓明，胡祥钰，
申请(专利权)人：北京亿森宝生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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