本发明专利技术提供一种基于磁珠法快速纯化特异性扩增PCR产物的方法。所述的方法首先将特异性扩增的PCR产物吸至离心管中，加入Buffer A，震荡、室温放置5min，在磁力架上进行磁珠分离；待磁珠吸附到离心管一侧时吸去液体；往含有磁珠的离心管中加入Buffer B,静止8min，在磁力架上进行磁珠分离；待磁珠吸附到离心管一侧时吸去液体，保留磁珠；加入Buffer C，在磁力架上进行磁珠分离，待磁珠吸附到离心管一侧时吸取溶液，即为回收后的PCR产物。使用磁珠法来纯化特异性扩增PCR产物，整个流程方便快捷，与常规纯化方法相比，本方法显得更加方便、快捷，不需要使用到离心机等设备。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种基于磁珠法快速纯化特异性扩增PCR产物的方法，属于生物
技术背景PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性一退火一延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93°C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55°C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸:DNA模板一引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性一退火一延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2?4分钟，2?3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。通过PCR获得的目的基因需要进一步纯化，这是因为PCR反应体系中含有dNTP、Mg2+、DNA聚合酶等物质，这些物质会对下游的实验产生影响，因此需要对获得的特异性扩增PCR产物进行进一步的纯化，目前常用的特异性扩增PCR产物的回收方法基本上都是吸附柱回收法。利用磁珠法来纯化特异性扩增PCR产物的方法目前未见报道。磁珠法纯化DNA主要是利用利息交换吸附材料吸附核酸，从而将核酸和其他杂质分离。使用磁珠法来纯化纯化特异性扩增PCR产物的最大优点就是自动化。磁珠在磁场条件下可以发生聚集或分散，整个流程方便快捷，不需要使用到离心机等设备。
技术实现思路
: 基于磁珠法快速纯化特异性扩增PCR产物的方法，使用磁珠法纯化特异性扩增PCR产物的最大优点就是自动化。磁珠在磁场条件下可以发生聚集或分散，整个流程方便快捷，不需要使用到离心机等设备。基于磁珠法快速纯化特异性扩增PCR产物的方法，主要包括利用磁珠法快速纯化PCR产物。磁珠法快速纯化PCR产物:将特异性扩增的PCR产物吸至1.5ml离心管，加入等体积的Buffer A0震荡10s。室温放置5min，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离。经观察，待磁珠吸附到离心管一侧时，吸去液体，保留磁珠。往含有磁珠的离心管中加入ImlBufferB,打匀后室温静止8min，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离。经观察，待磁珠吸附到离心管一侧时，吸去液体，保留磁珠。往含有磁珠的离心管中加入50 μ I Buffer C，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离。经观察，待磁珠吸附到离心管一侧时吸取溶液，此溶液即为回收后的PCR产物。于1%琼脂糖凝胶中电泳检测。磁珠为硅基生物磁珠，粒径为lum。Buffer A溶液的配置:异丙醇:磁珠混悬液的体积比为24:1，其中磁珠混悬液由磁珠和水按照1:2体积比配置。Buffer B 溶液的配置:24.3-21.4 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)，2.1-4.2mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)，42.9-85.7 mmol /T, Nacl，60-80% 无水乙醇。Buffer C 溶液的配置:8-10mmol/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)，ΡΗ=8.0-9.0。采用本方法能简单、快速地纯化特异性扩增的PCR产物。与以往的特异性扩增的PCR产物纯化方法相比，本方法不需要使用离心机等大型仪器。便于小实验室更好地开展分子生物学的相关研究。本专利技术的显著优点: 基于磁珠法快速纯化特异性扩增PCR产物的方法，使用磁珠法来纯化纯化特异性扩增PCR产物的最大优点就是自动化。磁珠在磁场条件下可以发生聚集或分散，整个流程方便快捷，不需要使用到离心机等设备。【附图说明】图1为大肠杆菌16s rDNA基因扩增结果。图2为16s rDNA基因纯化后的检测结果图。具体实施例图1中，泳道1，2，3，4是大肠杆菌16s rDNA基因扩增结果，泳道5是TAKARA公司的 DL2000 DNA marker0图2中，泳道1，2是利用磁珠法快速纯化16s rDNA基因PCR产物后的检测结果图，泳道 3 是 TAKARA 公司的 DL2000 DNA marker。本专利技术提供一种基于磁珠法快速纯化特异性扩增PCR产物的方法，该方法能通过磁珠吸附特异性扩增PCR产物，利用该方法能够在不使用离心机等大型仪器设备的条件下快速纯化特异性扩增PCR产物。具体步骤如下: 磁珠法快速纯化PCR产物:将4管50ul的16s rDNA基因PCR产物分成2组，每组2管混合加到1.5ml离心管，各加入10ul的Buffer A0震荡1s0室温放置5min，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离。经观察，待磁珠吸附到离心管一侧时，吸去液体，保留磁珠。往含有磁珠的离心管中加入ImlBuffer B,打匀后室温静止8min，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离。经观察，待磁珠吸附到离心管一侧时，吸去液体，保留磁珠。往含有磁珠的离心管中加入50 μ I Buffer C，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离。经观察，待磁珠吸附到离心管一侧时吸取溶液，此溶液即为回收后的PCR产物。于1%琼脂糖凝胶中电泳检测。磁珠为硅基生物磁珠，粒径为Ium0Buffer A异丙醇:磁珠混悬液的体积比为24:1，其中磁珠混悬液由磁珠和水按照1:2体积比配置。Buffer B溶液的配置:28.6mmol/L三轻甲基氨基甲烧(Tris), 3.4mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA) , BOmmoI /T, Nacl, 70% 无水乙醇。Buffer C溶液的配置:8mmol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)，PH=8.0。大肠杆菌16s rDNA基因扩增结果见图1，泳道1，2，3，4是大肠杆菌16s rDNA基因扩增结果，泳道5是DNA marker ο 16s rDNA基因纯化后的检测结果图见图2，泳道1，2是利用磁珠法快速纯化16s rDNA基因PCR产物后的检测结果图，泳道3是DNA marker。从图中可看出本方法可以快速对PCR产物进行纯化。【主权项】1.一种基于磁珠法快速纯化特异性扩增PCR产物的方法，主要包括利用磁珠法快速纯化PCR产物，其特征在于：将特异性扩增的PCR产物吸至I. 5ml离心管，加入等体积的Buffer A，震荡10s，室温放置5min ;将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，待磁珠吸附到离心管一侧时，吸去液体，保留磁珠，往含有磁珠的离心管中加入ImlBuffer B,打匀后室温静止8min，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，待磁珠吸附到离心管一侧时，吸去液体，保留磁珠，往含有磁珠的离心管中加入50 μ I Buffer C，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，待磁珠吸附到离心管一侧时吸取溶液，此溶液即为回收后的PCR产物，最后于1%琼脂糖凝胶中电泳检测。2.根据权利要求I所述的一种基于磁珠法快速纯化特异性扩增PCR产物的方法，其特征在于所述的磁珠为硅基生物磁珠，粒径为lum。3.根据权利要求I所述的一种基于磁珠法快速纯化特异性扩增PCR产物的方法，其特征在于所述的Buffer A溶液的配置为异丙醇：磁珠混悬液的体积比为2本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于磁珠法快速纯化特异性扩增PCR产物的方法，主要包括利用磁珠法快速纯化PCR产物，其特征在于：将特异性扩增的PCR产物吸至1.5ml离心管，加入等体积的 Buffer A，震荡10s，室温放置5min；将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，待磁珠吸附到离心管一侧时，吸去液体，保留磁珠，往含有磁珠的离心管中加入1mlBuffer B,打匀后室温静止8min，将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，待磁珠吸附到离心管一侧时，吸去液体，保留磁珠，往含有磁珠的离心管中加入50μl Buffer C,将离心管放在磁力架上，进行磁珠分离，待磁珠吸附到离心管一侧时吸取溶液，此溶液即为回收后的PCR产物，最后于1%琼脂糖凝胶中电泳检测。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王清水，余彦，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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