一种EV71病毒核酸质粒及其构建方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种EV71病毒核酸质粒，其中所述EV71病毒核酸质粒包括EV71病毒全长cDNA序列和真核表达质粒序列。本发明专利技术还提供了所述EV71病毒核酸质粒的构建方法，该病毒核酸质粒能够在肿瘤细胞中包装出活体病毒并引发肿瘤细胞的凋亡。本发明专利技术还提供了所述EV71病毒核酸质粒用于制备抑制实体瘤药物的用途。本发明专利技术的EV71病毒核酸质粒通过运载工具能够进入到肿瘤细胞中包装出活体病毒，引发肿瘤细胞的凋亡，有效提高病毒溶瘤的功能。

A nucleic acid plasmid of EV71 virus and its construction and Application

【技术实现步骤摘要】
一种EV71病毒核酸质粒及其构建方法及应用
本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种EV71病毒核酸质粒，以及该EV71病毒核酸质粒的构建方法，以及该EV71病毒核酸质粒用于制备抑制实体瘤药物的用途。
技术介绍
目前，大多数癌症治疗采用传统的手术、放疗、化疗方法，传统的癌症治疗技术存在副作用大的缺点，严重影响了癌症患者的生存质量。特别是当患者发展到癌症的中晚期时，传统的治疗技术效果不明显，预后较差，严重的副作用也影响到患者的生存质量。目前治疗癌症采用了免疫节点技术，取得一定的治疗效果。副作用小，在PD-1和PD-L1蛋白高表达的肿瘤患者中有效率可以达到50％，有效改善了患者的生存质量。但是近年来开始发现很多的癌症患者对PD-1单抗药物产生耐药性，特别是用了1年以上的患者。总体而言，癌症疾病是一种进化性复杂性疾病，单一靠一种治疗方法是无法解决的。溶瘤病毒发展多年，可以算是治疗肿瘤的新奇治疗的方法，该方法利用病毒直接凋亡肿瘤细胞的功能以及免疫刺激的作用。但是传统的溶瘤病毒治疗方法存在的一些瓶颈问题，比如免疫屏障、耐药等。由于人体天然的免疫屏障，溶瘤病毒一旦进入体内就会被机体的免疫物质所识别，比如抗病毒的中和抗体和各种免疫细胞，病毒在到达肿瘤细胞之前就会被中和抗体结合或者被免疫细胞所吞噬，只有极少量的病毒能够进入肿瘤细胞发挥功效。人体免疫系统大大降低了溶瘤病毒的功效。另外溶瘤病毒需要进入到肿瘤细胞中，必须借助肿瘤细胞上存在的受体蛋白。肿瘤细胞就是天生不断进化变异细胞，很快会进化出缺乏溶瘤病毒的受体蛋白的肿瘤细胞，此时溶瘤病毒就无法侵入这些变异的肿瘤细胞，从而产生耐药性。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够使肿瘤细胞凋亡的EV71病毒核酸质粒。本专利技术的另一个目的是提供所述EV71病毒核酸质粒的构建方法。本专利技术的再一个目的是提供所述EV71病毒核酸质粒的应用。为了实现以上目的，本专利技术提供了一种EV71病毒核酸质粒，其中所述EV71病毒核酸质粒质粒包括EV71病毒全长cDNA序列和真核表达质粒序列。此外，本专利技术还提供了所述EV71病毒核酸质粒的构建方法，该方法包括：提取EV71病毒RNA核酸，将所述EV71病毒RNA反转录为cDNA，然后再将EV71病毒cDNA全长序列利用同源重组的方法连接到真核质粒载体上，从而构建所述EV71病毒核酸质粒。优选地，所述构建方法的具体步骤如下：步骤1：提取EV71病毒的RNA；步骤2：将EV71病毒的RNA反转录为cDNA；步骤3：用EV71病毒引物扩增EV71病毒的cDNA片段，电泳扩增产物，然后回收扩增的EV71病毒cDNA核酸片段；步骤4：用真核表达质粒的引物扩增真核表达质粒的DNA片段，电泳扩增产物，然后回收扩增的真核表达质粒核酸片段；步骤5：连接步骤3所得到的EV71病毒cDNA核酸片段和步骤4所得到的真核表达质粒核酸片段，将连接产物转化到感受态细菌中，得到转化细菌；步骤6：将培养的转化细菌涂板到含有氨苄的LB琼脂板上，挑选单克隆细菌，筛选和鉴定连接成功的EV71病毒核酸质粒细菌。步骤7：将连接成功的EV71病毒核酸质粒细菌大量培养，抽提EV71病毒核酸质粒，抽提的所述EV71病毒核酸质粒经过转染鉴定后，加入保存液放置-20℃保存。优选地，本专利技术所述的EV71病毒包括A、B、C亚型，最优选为C型EV71病毒。优选地，本专利技术所述的真核表达质粒包括pcDNA-3.1、pcDNA-3.1-E、pcDNA3.1/Zeo(+/-)、pcDNA4、pcDNA4/HisMAX、pRc/RSV，最优选为pcDNA-3.1。本专利技术还提供了所述EV71病毒核酸质粒用于制备抑制实体瘤药物的用途。本专利技术还提供了所述EV71病毒核酸质粒用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物的用途。优选地，所述肿瘤是宫颈癌、肺癌、食道癌、乳腺癌、脑胶质瘤、黑色素瘤、肌肉瘤、胃癌、结肠癌、头颈癌、前列腺癌、卵巢癌中的一种或多种。本专利技术还提供了EV71病毒核酸质粒转染至细胞中的运载方法，其中体外转染EV71病毒核酸质粒至细胞，主要采用LIP3000转染方法；体内将EV71病毒核酸质粒转染至肿瘤细胞，主要采用脂质体、纳米材料方法等。其中体外转染病毒核酸质粒的方法优选脂质体方法。本专利技术还根据常规溶瘤病毒容易被机体中和抗体所阻断的特性，设计了体外中和抗体的细胞模型，将EV71病毒中和抗体添加至细胞培养液中，然后分别转染EV71病毒核酸质粒或者加入EV71病毒，观察两者的作用差别。结果显示本专利技术的EV71病毒核酸质粒能够在添加EV71病毒中和抗体的Hela细胞中包装出活体病毒，快速导致Hela细胞的凋亡。而EV71病毒则无法感染添加EV71病毒中和抗体的Hela细胞。以宫颈癌为例，本专利技术建立的宫颈癌实体瘤动物模型具体操作步骤如下：培养Hela细胞，消化细胞，用PBS溶液将离心后的hela细胞稀释至2*107个/ml浓度，保存在冰上。注射Hela细胞至Balb/c裸鼠的后肢外侧，注射量为0.2mL。一般2周后，裸鼠的肿瘤组织生长到500mm3(长*宽2/2)就可以开始注射EV71病毒核酸质粒药物。EV71病毒是引起5岁以下儿童手足口病的主要病原体，很少能够导致成人年患病。EV71病毒基因小，容易在肿瘤细胞中复制出活体病毒，病毒繁殖速度快，凋亡肿瘤细胞的效率高。因此本专利技术选择EV71病毒作为溶瘤病毒核酸质粒构建的研究对象。另外大多数成年人都存在EV71病毒中和抗体，EV71病毒核酸质粒在肿瘤细胞中包装出病毒，能够在肿瘤细胞表面展示EV71病毒蛋白，也会引发体内免疫系统攻击被病毒感染的肿瘤细胞，从而形成肿瘤细胞的二次攻击。本专利技术EV71病毒核酸质粒是通过运载工具(如脂质体或者纳米材料等)运载进入肿瘤细胞中，能够进入肿瘤细胞中包装出活体EV71病毒，通过直接裂解肿瘤细胞、破坏肿瘤细胞酶功能、释放病毒蛋白在肿瘤细胞表面，最终导致肿瘤细胞的凋亡，引发实体瘤组织的消亡，而不是通过肿瘤细胞上的受体蛋白作用。本专利技术提供的EV71病毒核酸质粒可以在大多数的肿瘤细胞中包装出活体病毒引发肿瘤细胞凋亡，而人体内不存在病毒核酸质粒的中和抗体，因此病毒核酸质粒在人体内不会被免疫系统识别和攻击，从而保证溶瘤的功效。病毒核酸质粒进入肿瘤细胞，是借助脂质体或者纳米材料等，主要是利用细胞膜存在负电荷的特点。肿瘤细胞膜带有负电荷的特性是不可能改变的，因此它无法通过进化抵抗病毒核酸质粒进入细胞膜。因此本专利技术提供的EV71病毒核酸质粒可以克服肿瘤组织异质性的问题，部分解决因为肿瘤变异而产生耐药性的问题。附图说明图1是EV71病毒核酸质粒组和EV71病毒组在中和抗体干扰下Hela细胞的存活率示意图。图2是EV71病毒核酸质粒组和EV71病毒组治疗荷瘤小鼠后肿瘤体积的变化示意图。图3是EV71病毒核酸质粒组和EV71病毒组治疗下肿瘤重量对比示意图。图4是本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种EV71病毒核酸质粒，其特征在于：所述EV71病毒核酸质粒包括EV71病毒全长cDNA序列和真核表达质粒序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种EV71病毒核酸质粒，其特征在于：所述EV71病毒核酸质粒包括EV71病毒全长cDNA序列和真核表达质粒序列。


2.根据权利要求1所述的EV71病毒核酸质粒，其特征在于：所述EV71病毒是A型、B型或C型EV71病毒中的任意一种。


3.根据权利要求1或2所述的EV71病毒核酸质粒，其特征在于：所述真核表达质粒是pcDNA-3.1、pcDNA-3.1-E、pcDNA3.1/Zeo(+/-)、pcDNA4、pcDNA4/HisMAX、pRc/RSV中的任意一种。


4.根据权利要求1或2所述的EV71病毒核酸质粒，其特征在于：所述真核表达质粒是pcDNA-3.1。


5.根据权利要求1至4所述的EV71病毒核酸质粒的构建方法，所述方法包括以下步骤：提取EV71病毒RNA核酸，将所述EV71病毒RNA反转录为cDNA，然后再将EV71病毒cDNA全长序列利用同源重组的方法连接到真核质粒载体上，从而构建所述EV71病毒核酸质粒。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述构建方法的步骤具体如下：
步骤1：提取EV71病毒的RNA；
步骤2：将EV71病毒的R...

【专利技术属性】
技术研发人员：王长兵，田新贵，游爱萍，刘文宽，周志超，李潇，周荣，
申请(专利权)人：广州医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：广东;44