奶牛气管抗菌肽基因乳腺特异性表达重组质粒及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供一种奶牛气管抗菌肽基因（

Construction and application of mammary gland specific expression recombinant plasmid of cow tracheal antimicrobial peptide gene

【技术实现步骤摘要】
奶牛气管抗菌肽基因乳腺特异性表达重组质粒及其构建方法和应用
本专利技术涉及一种奶牛气管抗菌肽基因乳腺特异性表达重组质粒及其构建方法和应用，属于基因重组和分子克隆

技术介绍
奶牛乳腺炎是奶牛常见病和多发病，随着奶牛乳腺炎发病率上升,大大降低奶牛产奶量，并严重影响原料奶质量。因此，奶牛乳房炎的治疗越来越受重视。目前主要治疗手段是抗生素、中药制剂的药物治疗，而抗生素的使用，耐药菌株产生及乳中药物残留严重危害到消费者的健康，因此奶牛乳房炎的治疗以成为世界难题。少用或不用抗生素，有效控制药物残留，保证原料奶安全及奶牛产奶量是奶牛乳腺炎防控的主要目标。气管抗菌肽(Trachealantimicrobialpeptide，TAP)是1991年发现的一种β-防御素，病原微生物和多种促炎因子均能特异性诱导TAP基因在奶牛乳腺组织表达上调，最大上调数十倍，增强了乳腺组织的防御能力。防御素具有广谱的抗菌活性和特殊抗菌机理，有关其基因工程、生物学活性及表达调控研究是当前国内外所普遍关注的，预计它将为解决日益严重的细菌耐药性问题提供强有力的帮助。某些哺乳动物防御素在提高巨噬细胞吞噬能力方面有很大的作用，可以促进成纤维细胞的有丝分裂，进而修复炎症部位的组织和细胞。人防御素对单核细胞具有强有效的趋化作用，并且在炎症反应中充当嗜中性粒细胞的趋化信号。当机体感染病原体时，某些类型的防御素表达上调，这有助于机体抵抗和杀死病原微生物。研究表明，使用细菌脂多糖刺激患有乳腺炎的小鼠的乳腺，可以导致小鼠乳腺中β-防御素1的表达量上调。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，构建一种奶牛气管抗菌肽基因乳腺特异性表达重组质粒，在该质粒5’端构建乳腺特异性表达调控区，靶基因可以在乳腺组织中特异性表达，通过提高奶牛乳腺中气管抗菌肽这种天然抗菌物质的表达水平，为防治奶牛乳腺炎提供重要材料。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供一种奶牛气管抗菌肽基因乳腺特异性表达重组质粒，增强型绿色荧光蛋白通用表达载体pEGFP-N1质粒的HindIII和SacII多克隆位点处插入TAP基因，且pEGFP-N1质粒的CMV启动子序列替换为BLG基因启动子序列；所述的TAP基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，所述的BLG基因启动子的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。本专利技术还提供一种奶牛气管抗菌肽基因乳腺特异性表达重组质粒的构建方法，包括以下步骤：采用HindIII和SacII对pEGFP-N1质粒进行双酶切，将酶切后的pEGFP-N1质粒通过同源重组和TAP基因进行连接，构建重组质粒pEGFP-N1-TAP；采用AseI和HindIII对重组质粒pEGFP-N1-TAP进行双酶切，切除pEGFP-N1载体原有的CMV启动子序列，将BLG启动子基因序列同源重组替换到AseI和HindIII酶切位点，构建奶牛气管抗菌肽基因乳腺特异性表达重组质粒pBLG-EGFP-N1-TAP。进一步地，所述TAP基因的制备方法包括：提取奶牛乳腺上皮细胞总RNA；将奶牛乳腺上皮细胞总RNA反转录成cDNA；以奶牛乳腺上皮细胞cDNA为模板，以P1、P2为奶牛TAP引物，RT-PCR扩增TAP基因编码序列；其中，所述P1引物具有序列表中SEQIDNo:4所示的核苷酸序列，所述P2引物具有序列表中SEQIDNo:5所示的核苷酸序列。进一步地，所述RT-PCR扩增体系为：模板cDNA为1μl，P1、P2引物各1μl，TakaraprimeSTARMIX为10μl，ddH2O补足至20μl；P1、P2引物的浓度均为0.1nmol/μl。进一步地，所述RT-PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性10s，52℃退火20s，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸7min。进一步地，所述BLG启动子基因的制备方法包括：提取奶牛血液基因组DNA；以奶牛血液基因组DNA为模板，以P3、P4为奶牛BLG引物，PCR扩增BLG启动子基因；其中，所述P3引物具有序列表中SEQIDNo:6所示的核苷酸序列，所述P4引物具有序列表中SEQIDNo:7所示的核苷酸序列。进一步地，所述PCR扩增体系为：模板DNA为1μl，P3、P4引物各1μl，TakaraprimeSTARMIX为10μl，dH2O补足至20μl，P3、P4引物的浓度均为0.1nmol/μl。进一步地，所述PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，58℃退火30s，72℃延伸2min，共35个循环；72℃延伸7min。本专利技术还提供一种上述的重组质粒在奶牛乳腺组织免疫机制研究中的应用，将上述的重组质粒转染至乳腺细胞，通过绿色荧光显微镜观察绿色荧光蛋白基因表达情况，检测奶牛气管抗菌肽基因的表达情况。本专利技术还提供一种上述的重组质粒在基因治疗奶牛乳房炎制剂的研发中应用，将上述的重组质粒转染至哺乳动物体内，重组质粒在哺乳动物体内表达奶牛气管抗菌肽基因，表达产物具有抗菌效果，对哺乳动物健康无显著影响。本专利技术所达到的有益效果：1、本专利技术构建重组质粒采用的是BLG基因启动子，并选取了特定的启动子序列，基于该方法所构建的重组质粒具有高特异性、高灵敏度和高准确度，可使奶牛气管抗菌肽基因在乳腺细胞中特异性高表达。2、本专利技术构建了一种含BLG基因启动子、奶牛气管抗菌肽基因(TAP)和增强的绿色荧光蛋白基因的乳腺特异性表达奶牛气管抗菌肽基因的重组质粒，可用于奶牛乳腺组织免疫机制研究和基因治疗奶牛乳房炎制剂的研发。3、本专利技术使用重组质粒转染至泌乳高峰期ICR小鼠体内，重组质粒在体内乳腺组织特异性表达奶牛气管抗菌肽基因，表达产物具有抗菌效果。应用于基因治疗奶牛乳房炎制剂的研发，进而代替常规抗生素等药物，使用后可大大提高乳腺组织及牛乳中气管抗菌肽表达量，不仅可以直达病灶杀死病原菌，起到治疗治疗牛乳房炎的效果，还会切断病源菌从乳头管进入乳房的通道，减少乳房炎的感染途径，达到治疗和预防乳房炎的目的，同时因不用抗生素，不产生耐药性问题，牛乳中气管抗菌肽含量的提升还会使牛乳不易变质，更加健康。4、本专利技术使用重组质粒转染至泌乳高峰期ICR小鼠体内，重组质粒在体内乳腺组织特异性表达奶牛气管抗菌肽基因，对ICR小鼠健康无显著影响。5、本专利技术在研发新型可替代抗生素产品方面有广泛的应用前景。附图说明图1.实施例1中，TAP基因PCR扩增图。M：100bpDNALadder；1-5：TAP片段扩增；6：ddH2O。注：236bp是192bpTAP+22bp上游同源臂+22bp下游同源臂。图2.实施例1中，增强型绿色荧光蛋白通用表达载体pEGFP-N1结构示意图。图3.实施例1中，TAP重组载体菌液PCR检测图。M：100bpDNALadder；1-5：菌液PCR检测。注：其中1、5号检测到目的条带。图4.实施例1中，BLG启动子PCR扩本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.奶牛气管抗菌肽基因乳腺特异性表达重组质粒，其特征是，增强型绿色荧光蛋白通用表达载体pEGFP-N1质粒的

【技术特征摘要】
1.奶牛气管抗菌肽基因乳腺特异性表达重组质粒，其特征是，增强型绿色荧光蛋白通用表达载体pEGFP-N1质粒的HindIII和SacII多克隆位点处插入TAP基因，且pEGFP-N1质粒的CMV启动子序列替换为BLG基因启动子序列；所述的TAP基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，所述的BLG基因启动子的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。


2.根据权利要求1所述的奶牛气管抗菌肽基因乳腺特异性表达重组质粒的构建方法，其特征是，包括以下步骤：
采用HindIII和SacII对pEGFP-N1质粒进行双酶切，将酶切后的pEGFP-N1质粒通过同源重组和TAP基因进行连接，构建重组质粒pEGFP-N1-TAP；
采用AseI和HindIII对重组质粒pEGFP-N1-TAP进行双酶切，切除pEGFP-N1载体原有的CMV启动子序列，将BLG启动子基因序列同源重组替换到AseI和HindIII酶切位点，构建奶牛气管抗菌肽基因乳腺特异性表达重组质粒pBLG-EGFP-N1-TAP。


3.根据权利要求2所述的奶牛气管抗菌肽基因乳腺特异性表达重组质粒的构建方法，其特征是，所述TAP基因的制备方法包括：
提取奶牛乳腺上皮细胞总RNA；
将奶牛乳腺上皮细胞总RNA反转录成cDNA；
以奶牛乳腺上皮细胞cDNA为模板，以P1、P2为奶牛TAP引物，RT-PCR扩增TAP基因编码序列；
其中，所述P1引物具有序列表中SEQIDNo:4所示的核苷酸序列，所述P2引物具有序列表中SEQIDNo:5所示的核苷酸序列。


4.根据权利要求3所述的奶牛气管抗菌肽基因乳腺特异性表达重组质粒的构建方法，其特征是，所述RT-PCR扩增体系为：模板cDNA为1µl，P1、P2引物各1µl，TakaraprimeSTARMIX为10µl，ddH2O补足至20µl；P1、P2引物的浓度均为0....

【专利技术属性】
技术研发人员：张志鹏，杨章平，杨奕，陈代杰，张慧敏，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32