一种光控基因转录抑制系统及抑制、构建方法技术方案

本发明专利技术公开一种光控基因转录抑制系统及抑制、构建方法。主要是利用CRISPR系统设计不同sgRNA靶向不同的目的基因。通过引入光控转录抑制系统，在不同的光照条件下，通过蓝光依赖性光响应蛋白cib1和cry2互作驱动HDAC间接作用于靶基因，使其结合至靶基因位点，使组蛋白去乙酰化，基因的转录受到抑制，从而实现光控基因转录抑制。利用“CRISPR基因靶向‑光遗传基因调控”技术，实现VEGF因子及受体基因的精准靶向；同时利用光遗传调控技术，根据个体差异，实现VEGF因子及受体分子的动态实时可控调节。

A light controlled gene transcription inhibition system and its inhibition and construction method

【技术实现步骤摘要】
一种光控基因转录抑制系统及抑制、构建方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种光控基因转录抑制系统及抑制、构建方法。
技术介绍
随着人口老龄化的扩大，老年病问题凸显，其中常见眼底疾病(如黄斑变性、眼底出血、糖尿病性视网膜病变等)往往导致视力严重衰退甚至失明，严重影响中老年人生活质量。然而临床治疗上述眼底疾病过程中仍存在着难以解决的缺陷如：1)治疗作用“不持久”，2)治疗作用“易失控”，3)治疗作用“不协同”等，导致临床治疗效果不佳。目前利用抗VEGF方法治疗新生血管性眼底病变，是目前临床的通用策略。治疗过程需反复多次进行，但效果欠佳，无法有效逆转损伤。这种治疗现状不仅为患者家庭造成沉重经济负担，同时容易贻误眼底病变治疗最佳时机，导致不可逆损伤甚至失明，严重影响患者生存质量。针对新生血管性眼底病变难防治临床现状，本项目拟将“CRISPR基因靶向技术”与“光遗传蛋白调控技术”相结合，提出抗VEGF策略高协同治疗策略。本项目的总体目标是拟将“CRISPR基因靶向技术”与“光遗传蛋白调控技术”相结合，构建精准可控纳米递药新系统，提出本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种光控基因转录抑制系统，其特征在于：所述系统包括sgRNA,dCas9-cib1,cry2-HDAC质粒表达载体；/n其中，所述sgRNA为基因抑制系统靶向部分，设计不同的sgRNA具有特异的靶向性，能够招募dCas9酶；/n所述cib1和cry2为蓝光依赖性光响应蛋白，在488nm蓝光的调控下,发生光响应性互作；/n所述HDAC是一类蛋白酶；/n该系统在蓝光作用下，HDAC结合至靶基因位点，使组蛋白去乙酰化，与带负电荷的DNA紧密结合，染色质致密卷曲，基因的转录受到抑制。/n

【技术特征摘要】
1.一种光控基因转录抑制系统，其特征在于：所述系统包括sgRNA,dCas9-cib1,cry2-HDAC质粒表达载体；
其中，所述sgRNA为基因抑制系统靶向部分，设计不同的sgRNA具有特异的靶向性，能够招募dCas9酶；
所述cib1和cry2为蓝光依赖性光响应蛋白，在488nm蓝光的调控下,发生光响应性互作；
所述HDAC是一类蛋白酶；
该系统在蓝光作用下，HDAC结合至靶基因位点，使组蛋白去乙酰化，与带负电荷的DNA紧密结合，染色质致密卷曲，基因的转录受到抑制。


2.如权利要求1所述的光控基因转录抑制系统的构建方法，其特征在于，主要步骤如下：
⑴基因靶向sgRNA质粒表达载体的构建：
以pmU6-gRNA为载体，根据sgRNA设计一对引物，以酶切线性化pmU6-sgRNA质粒，并对酶切后的载体进行回收,将退火配对后的sgRNA碱基与回收后的载体进行连接；
其中，所述sgRNA序列的核苷酸序列为SEQ.No.1；
⑵dCas9-cib1表达质粒的构建：
以pcDNA3.1(+)为载体，设计载体反向PCR引物与cib1引物，将cib1通过同源重组的方式连接到dCas9载体上；
其中，所述-dCas9-cib1-序列的氨基酸序列为SEQ.No.2；
⑶cry2-HDAC表达质粒的构建：
以pcDNA3.1(+)为载体，设计载体反向PCR引物与cry2引物，将cry2通过同源重组的方式连接到HDAC载体上；
其中，所述-cry2-HDAC-序列的氨基酸序列为SEQ.No.3；
⑷细胞培养与细胞转染：
搭建光控平台，对细胞进行光照处理，即可实现对靶基因的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王汉杰，李佳桦，常津，郝亚锋，潘惠卓，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12