本发明专利技术提供一种用于检测组蛋白豆蔻酰化修饰的重组蛋白及其应用。本发明专利技术的重组蛋白的氨基酸序列包括优化PHD结构域序列，其中，优化PHD结构域序列为：a)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或b)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。本发明专利技术的重组蛋白可以特异性识别H3K14cr，用于替代商业化抗体来进行Western Blot实验，预期成本低，批次质量十分稳定，可以快速实现批量化生产。
【技术实现步骤摘要】
一种用于检测组蛋白豆蔻酰化修饰的重组蛋白及其应用
本专利技术涉及蛋白修饰检测的
，更具体地，涉及一种用于检测组蛋白豆蔻酰化修饰的重组蛋白及其应用。
技术介绍
组蛋白是染色体的重要组成部分。组蛋白会经历100多种不同的翻译后修饰，比如磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化和糖基化。这些翻译后修饰是调控染色体的结构和功能的重要方式，对发育、代谢、疾病等众多生理过程均起到关键的调控作用。研究这些组蛋白修饰具有重要意义，系统地定位这些组蛋白修饰已成为众多国际性大课题的焦点。这些组蛋白修饰在基因组范围的定位需要借助针对这些组蛋白修饰的特异性抗体。赖氨酸侧链具有两种特性：电荷丰富和亲核性，适合翻译后修饰与不同的亲电底物以共价键结合。赖氨酸上可发生很多翻译后修饰，如甲基化，乙酰化，生物素化，泛素化，豆蔻酰化和sumo化修饰等，这些修饰在细胞生理和病理中有重要作用。组蛋白上的赖氨酸可被如甲基化，乙酰化，泛素化，sumo化、核糖体化和豆蔻酰化修饰等。其中，豆蔻酰化也称十四酰化，采用豆蔻酸作为酰基进行的酰化作用，在基因转录和调节中具有重要的生物学功能。目前，针对组蛋白不同位点赖氨酸上的豆蔻酰化，通常购买商业化的抗组蛋白特定修饰位点的多抗，但是经动物免疫获得的抗体价格昂贵，批次质量不稳定，容易发生交叉反应，满足特定位点修饰的抗体制备周期很长，产量低，严重制约了对组蛋白豆蔻酰化修饰的高通量检测。
技术实现思路
(一)要解决的技术问题本专利技术要解决的技术问题是针对组蛋白豆蔻酰化修饰位点的商业化抗体价格昂贵，各批次质量不稳定，交叉反应明显，特定位点修饰的抗体制备周期长，产量低。(二)技术方案为了解决上述技术问题或者至少部分地解决上述问题，本专利技术提供了一种重组蛋白，重组蛋白的氨基酸序列包括优化PHD结构域序列，其中，优化PHD结构域序列为：a)SEQIDNo.1所示的氨基酸序列；或b)SEQIDNo.1所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。应当理解，本领域技术人员可根据本专利技术公开的重组蛋白包含优化PHD结构域序列SEQIDNO.1片段，在不影响其活性的前提下，本专利技术的重组蛋白还包括SEQIDNO.1所示氨基酸序列取代、缺失或增加一个或几个氨基酸，具有与含有优化PHD序列的重组蛋白同等活性的由优化PHD序列衍生得到的蛋白质。本专利技术通过区段优化的方法优化PHD1-PHD2结构域，利用大肠杆菌Origami2DE3重组表达和纯化含有PHD结构域的重组蛋白，得到含优化PHD结构域序列的重组蛋白，该重组蛋白包含了N端多聚组氨酸标签，提高对H3K14cr亲和力。为了得到亲和力更佳的重组蛋白，优化的PHD结构域序列选自DPF2。在本专利技术一个优选实施方式中，为了得到质量稳定的重组蛋白，重组蛋白的氨基酸序列还包括融合蛋白标签的氨基酸序列。在本专利技术一个实施方式中，融合蛋白标签优选为HA标签、Myc标签或FLAG标签。在本专利技术一个优选实施方式中，可以利用大肠杆菌Origami2DE3重组表达和纯化含有PHD结构域的重组蛋白，该重组蛋白包含了N端多聚组氨酸标签，中间的SUMO融合蛋白，随后的PHD双结构域和C端的HA标签(Myc标签或FLAG标签可选)，即HIS8-SUMO-PHD-HA，HIS8-SUMO-PHD-Myc或HIS8-SUMO-PHD-FLAG，在实验室规模即可方便的纯化得到大量的，质量稳定的重组蛋白。在本专利技术一个优选实施方式中，重组蛋白的氨基酸序列为：a)SEQIDNo.3、SEQIDNo.4或SEQIDNo.5所示的氨基酸序列；或b)SEQIDNo.3、SEQIDNo.4或SEQIDNo.5所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。应当理解，本领域技术人员可根据本专利技术公开的重组蛋白包含优化PHD结构域序列SEQIDNO.3(HIS8-SUMO-PHD-HA)、SEQIDNo.4(HIS8-SUMO-PHD-Myc)或SEQIDNo.5(HIS8-SUMO-PHD-FLAG)片段，在不影响其活性的前提下，本专利技术的重组蛋白还包括SEQIDNO.1所示氨基酸序列取代、缺失或增加一个或几个氨基酸，具有与上述含有优化PHD序列的重组蛋白同等活性的由上述含有优化PHD序列的片段衍生得到的蛋白质。本专利技术涉及的SEQIDNo.3，SEQIDNo.4，SEQIDNo.5重组蛋白还分别包括了不同的免疫检测标签，方便了对后续抗体使用的兼容性，即只要含有上述3种通用标签抗体之中的任何一个，都可以完整地实现检测实验。根据本专利技术的一个方面，本专利技术还提供了编码上述重组蛋白的基因。在本专利技术一个优选实施方式中，上述基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。根据本专利技术的另一个方面，本专利技术还提供了提供含有上述基因的重组表达载体，可以方便转化大肠杆菌宿主细胞，进行重组蛋白的表达。在本专利技术一个实施方式中，可以为载体pET28a,来源于Novagen公司。根据本专利技术的另一个方面，本专利技术还提供了含有上述表达载体的宿主细胞。在本专利技术中，可以使用商业化菌株，如BL21(DE3),OrigamiB(DE3)等含DE3溶源的大肠杆菌。根据本专利技术的另一个方面，本专利技术还提供了上述重组蛋白的制备方法，包括：1)首先全基因优化合成HIS8-SUMO-PHD-HA核苷酸序列，翻译的氨基酸序列与SEQIDNo.3所示序列保持一致；合成的基因克隆到pUC57载体中；2)分别合成2对引物,以Myc序列或FLAG序列替换HA标签序列，分别获得含有SEQIDNo.4或SEQIDNo.5基因序列的pUC57载体；3)含SEQIDNo.3或4或5的核苷酸序列通过酶切，亚克隆到pET28a载体或同等效果的pET系列载体中，筛选得到正确的重组载体，分别可以编码SEQIDNo.3或4或5所示的氨基酸序列；4)以步骤3)获得的重组载体转化大肠杆菌感受态细胞BL21DE3或其它DE3溶源的大肠杆菌,可以得到该重组蛋白的可溶性表达；5)依据步骤4)，从1L液体LB诱导表达的发酵液中获得约30mgSEQIDNo.3或4或5氨基酸序列一致的重组蛋白。根据本专利技术的另一个方面，本专利技术还提供了含有上述重组蛋白的检测试剂盒。根据本专利技术的另一个方面，本专利技术还提供了使用上述重组蛋白在检测组蛋白位点豆蔻酰化修饰中的应用。更选地是，组蛋白位点为组蛋白H3中14位赖氨酸的位点。在本专利技术的实施方式中，组蛋白可以取自人、鼠、马、牛、猪、绵羊、山羊、鸡、狗、猫、果蝇、线虫和酵母等细胞中。在该应用中，使用上述重组蛋白与抗免疫标签通用抗体以及HRP标记的羊抗鼠IgG多抗，经过结合和信号放大，可得到高灵敏度的检测效果。其中，根据SEQIDNo.3，SEQIDNo.4，SEQIDNo.5所述的重组蛋白特征，在蛋白免疫印记检测中，分别使用抗免疫标签HA或Myc或FLAG通用抗体。在该应用中，以SEQIDNo.3所述的重组蛋白为例，检测方法具体为：1)提取待检测蛋白质，并将其转移至硝酸纤维膜(NC)上，封闭，TBST洗涤；2)使用PBS稀释后的重组蛋白(HIS8-SUMO-PHD-HA)孵育，加入小鼠抗HA单抗和带HRP的羊抗鼠IgG多抗孵育，观察免疫印迹结果。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列包括优化PHD结构域序列，其中，所述优化PHD结构域序列为：a)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或b)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列包括优化PHD结构域序列，其中，所述优化PHD结构域序列为：a)SEQIDNo.1所示的氨基酸序列；或b)SEQIDNo.1所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列还包括融合蛋白标签的氨基酸序列。3.根据权利要求2所述的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列为：a)SEQIDNo.3、SEQIDNo.4或SEQIDNo.5所示的氨基酸序列；或b)...
【专利技术属性】
技术研发人员：李珊珊，
申请(专利权)人：武汉博欧特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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