FVIII的位点定向修饰制造技术

本发明专利技术涉及FVIII的位点定向修饰，还涉及因子VIII突变蛋白，其在非N-末端胺的预定位点共价结合到一个或多个生物相容的聚合物，如聚乙二醇上。突变蛋白缀合物保留了FVIII前凝血剂活性，且具有提高的药物代谢动力学性质。

【技术实现步骤摘要】
【专利说明】 本申请是申请日为2005年11月14日、申请号为201310125428. 4、专利技术名称为 "FVIII的位点定向修饰"的PCT申请的分案申请。 与相关申请的交叉参考 本申请要求享有2004年11月12日提交的美国专利申请系列号60/627, 277的优 先权利益，其在运里整体引作参考。
本专利技术设及因子VIII(FVIII)突变蛋白，其允许在确定的位点偶联一个或多个生 物相容的聚合物如聚乙二醇。另外，提供了用于治疗目的的相关的制剂、其剂量及施用方 法。运些修饰的FVHI变体和相关的组合物和方法用于给遭受血友病A的个体提供具有减 少的注射频率和减少的免疫原性应答的治疗选择。
技术介绍
血友病A是最常见的遗传性凝结障碍，估计的发病率为1/5000男性。它的原因是 FVIII的缺乏或结构缺陷，所述FVIII是血液凝结的固有途径中的关键组分。目前血友病A 的治疗包含静脉内注射人FVIII。已经重组地生产了人FVIII，作为约300kD的单链分子。 它由结构域A1-A2-B-A3-C1-C2 组成灯hompson，2003,Semin.Hematol.29,卵.11-22)。前 体产物在高尔基体中被加工成200kD(重链）和80kD(轻链）的2条多肤链，运2条链通过 金属离子结合到一起化aufman等，1988，J.Biol.Qiem. 263,P.6352;Andersson等，1986， Proc.化tl.Acad.Sci. 83,p. 2979)。FVIII的B-结构域似乎是可有可无的，因为还已经显示B-结构域缺失的 FVIII度DD，90kDA1-A2重链+80kD轻链）可W有效地用作血友病A的替补疗法。B-结构 域缺失的FVIII序列含有B-结构域的14个氨基酸W外的所有缺失。 目前，通过根据需要静脉内施用FVHI来治疗血友病A患者，或者作为预防疗法每 周施用几次。关于预防治疗，每周施用15-25IU/kg体重的因子VIII3次。患者总是需要它。 因为它在人中的半衰期短，所W必须频繁地施用FVIII。尽管全长蛋白具有大于300kD的大 尺寸，但。￥111具有仅约11小时的人中的半衰期巧*611316；1.化111曰1:〇1.41， PP. 1-16)。对频繁的静脉内注射的需要造成患者顺应性的巨大障碍。如果可W开发具有更 长的半衰期且因而需要更低频率的施用的FVHI产物，则会更方便患者。另外，如果提高了 半衰期，那么由于需要更低的剂量，可W降低治疗费用。 现有疗法的另一个缺点是，约25-30%患者发展抑制FVIII活性的抗体（Saenko 等，2002,化emo地ilia8,PP. 1-11)。抑制性抗体的主要表位定位于A2结构域中的残基 484-508、A3结构域中的残基1811-1818和C2结构域。抗体发展阻止FVIII作为替补疗法 的应用，迫使该组患者寻求使用高剂量重组因子Vila的甚至更昂贵的治疗和免疫耐受疗 法。 下面的研究鉴别出了抑制性抗体的FVIII表位。在25份抑制性血浆样品的研究 中，发现11份结合凝血酶产生的73kD轻链片段A3C1C2,4份结合A2结构域，且10份结合 二者（Rilcher，C.等，1985,Proc.化tl.Acad.Sci. 2(22)，PP. 7728-32)。在另一项研究中， 重组A2多肤中和了 8种来自患者的A2结构域抑制剂中的6种（Scandella，化等，1993， Blood82化），PP. 1767-75)。将9种来自患者的抑制剂中的6种的表位作图到A2残基 379-538 (Scandella，D.等，1988,Proc.化tl.Acad.Sci. 85 (16)，PP. 6152-6)。18 种重链抑 制剂的表位定位于相同的A2结构域N-末端18. 3kD区域（Scandella，化等，1989,Blood 74(5)，pp. 1618-26)。 通过用同源猪序列替代人A2结构域残基387-604产生的有活性的重组杂种人 / 猪FVIII分子，对患者A2 抑制剂是抗性的（Lubin，I.等，1994,J.Biol.Chem. 269(12)， PP.8639-41)，且对与患者A2抑制剂竞争结合A2的鼠单克隆抗体mAB413IgG是抗性的 (Scandella，D.等，1992，1"虹ombHaemost. 67(6)，PP. 665-71)。当实验表明mAB413IgG 和4种患者抑制剂不抑制其中用猪序列替代A2结构域残基484-508的杂种人/猪FVIII 时，该A2结构域表位进一步定位于A2结构域残基484-508Ofealey，J.等，1995,J.Biol. 化em. 270 (24)，pp. 14505-9)。该杂种FVHI还对筛选的23份患者血浆的至少一半是更高抗 性的度arrow,R.等，2000,Blood95(2)，PP. 564-8)。丙氨酸扫描诱变鉴别的残基487对结 合测试的所有5种患者抑制剂都是关键的，而残基484、487、489和492对于与mAB413IgG 的相互作用都是重要的（Lubin，I.，J.Biol.Chem. 272 (48)，PP. 30191-5)。在接受R484A/ R489A/P492A突变体（而不是R484A/R489A突变体）的小鼠中的抑制性抗体效价，显著低于 接受对照人抓DFVIII的小鼠（Parker，E.等，2004，Blood104(3)，pp.704-10)。总之，A2 结构域的484-508区域似乎是FVIII活性的抑制剂的结合位点。 除了发展对FVIII的免疫应答W外，常规疗法的另一个问题是，其需要频繁的给 药，因为FVIII的体内半衰期短。已经研究了从循环清除FVIII的机理。[001引从循环清除FVIII，已部分地归因于向低密度脂蛋白受体-相关蛋白化RP) 的特异性结合，所述LRP是具有广泛配体特异性的肝清除受体（Oldenburg等，2004， 化emo地ilialOSu卵1 4,卵.133-139)。最近，还表明低密度脂蛋白（LDL)受体在FVIII清 除中起作用，如通过与LRP协同调节FVIII的血浆水平度ovenschen等，2005,Blood106， PP.906-910)。两种相互作用都被结合细胞表面硫酸肝素蛋白聚糖化SPG)所促进。当LRP 被封闭时，可W使在小鼠中的血浆半衰期延长3. 3倍，或者当LRP和细胞表面HSPG都被 封闭时，可W延长 5.5 倍（Sarafanov等，2001，J.Biol.Chem. 276,卵.11970-11979)。推 测服PG将FVm集中在细胞表面上，并将其呈递给LRP。FVm上的LRP结合位点已经被 定位在A2 残基 484-509(Saenko等，1999,J.Biol.Chem. 274,卵.37685-37692)、A3 残基 1811-1818 度ovenschen等，2003,J.Biol.Chem. 278,PP. 9370-9377)和C2 结构域中的表位 (Xenting等，1999,J.Biol.Qiem. 274,PP. 23734-23739)。[00本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有因子VIII前凝血剂活性的缀合物在制备用于在已经发展因子VIII抑制抗体的患者中治疗血友病的药物中的用途，所述缀合物包含共价附着到一个或多个生物相容的聚合物的功能因子VIII多肽。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘小群，JE墨菲，梅柏松，JS斯特劳斯，H坦德拉，陈建敏，T巴内特，唐亮，汪德潜，
申请(专利权)人：拜尔健康护理有限责任公司，
类型：发明
国别省市：美国;US