修饰的蜘蛛丝蛋白制造技术

本发明专利技术涉及修饰蜘蛛丝蛋白的方法和可通过所述方法获得的蜘蛛丝蛋白。本发明专利技术还涉及编码修饰的蜘蛛丝蛋白的核酸序列，含有所述序列的载体，和用这种载体转化的宿主细胞。此外，本发明专利技术涉及含有本文定义的修饰的蜘蛛丝蛋白的药物或化妆品组合物，和所述修饰的序列在各种领域中的应用，特别是在医药、化妆品和技术应用领域中的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】修饰的蜘蛛丝蛋白本专利技术涉及修饰蜘蛛丝蛋白的方法和可通过所述方法获得的蜘蛛丝 蛋白。本专利技术还涉及编码修饰的蜘蛛丝蛋白的核酸序列，包含所述序列的 载体，和转化所述载体的宿主细胞。此外，本专利技术涉及含有本文定义的修 饰的蜘蛛丝蛋白的药物或化妆品组合物，以及所述修饰的序列在各种领域 10中的应用，特别是在医药、化妆品和技术应用领域中的应用。蜘蛛丝是显示优越物理性质的蛋白聚合物。在不同类型的蜘蛛丝中，拖丝是被最集中研究的。拖丝的丝被圆网蜘蛛(orb weaving spiders)用于构 建它们的网的框架和半径并作为总是拖在后面的生命线。为了这些目的， 需要高的拉伸强度和弹性。这些性质的组合导致比大多数其它已知材料的 15韧性更高的韧性。拖丝的丝通常由两种主要的蛋白组成，其主要结构具有 共同的重复结构。一种圆网捕获螺线，部分由鞭形腺体形成的粘丝组成，因此其叫作鞭 形丝，是可延伸的，并且在断裂前可以在长度上延伸3倍，但是仅仅提供 拖丝的丝的一半的拉伸强度。 20 可以包含多到60个氨基酸的单重复单位的变化被重复数次来表示蜘蛛丝序列的最大部分。这些重复单位表示有限组的独特的氨基酸基序。在 所有的拖丝的丝重复单位中发现的一个基序是典型地6-9个丙氨酸残基的 结构单元。在丝线中，数种聚丙氨酸基序形成晶态的e-折叠堆积，产生 拉伸强度。25 富含甘氨酸的基序诸如GGX或GPGXX采用柔性的螺旋状结构，其连接晶态区域并给线提供弹性。丝的体内装配是引人注意的过程。蜘蛛的拖丝丝蛋白在所谓的主要的 壶腹腺中以多到50。/。(w/v)的浓度贮存。尽管已经提出在主要的壶腹腺中 关于这些蛋白质的"动态松散螺旋结构"，但是更近的数据提示对于所述30蛋白质的所谓A-区的随机巻曲构象，其代表所述腺体的最大部分。高度浓縮的蛋白质溶液形成丝粘稠物(纺丝溶液(spinning solution)),其显示液 态晶体的性质。线的装配在粘稠物通过纺织导管的通道中开始，伴随水、钠和氯化物 的提取。同时，易溶离子钾(more lyotropic ions potassium)和磷酸盐的浓 5度增加，pH从6.9降到6.3。装配最终由机械压力引发，其由线被推出蜘 蛛的腹部而引起。出于一些目的，天然丝线不能直接使用，而必须溶解并且再装配成其 它形态，诸如薄膜、泡沫、球体、纳米纤维、水凝胶等。尽管蜘蛛丝蛋白的某些结构方面己经清楚，但是关于个体丝蛋白和它 io们的主要结构元件对于装配过程的贡献则知道的很少。关于花园蜘蛛十字 园蛛04ra"船^^emato)的两种主要的拖丝丝蛋白，ADF-3和ADF-4的比 较研究揭示，尽管它们的氨基酸序列非常相似，但是它们显示显著不同的 溶解度和装配特性:尽管ADF-3甚至在高浓度仍是可溶的，但是ADF-4实 际上是不可溶的，并且在特定条件下自装配为纤丝状结构(未公开的结15 果)。科学和商业利益促进了蜘蛛丝的工业规模生产的研究。由于蜘蛛的同 种相残，天然的蜘蛛丝生产是不切实际的，而人工生产在获得足够的蛋白 质产量和出众的线-装配中遇到问题。细菌的表达产生低蛋白水平，这可 能是由于在细菌和蜘蛛中不同的密码子选用导致的。具有适应于表达宿主 20的密码子选用的合成基因导致更高的产量，但是其合成的蛋白质显示与天然蜘蛛丝不同的性质。部分拖丝的丝cDNAs在哺乳动物细胞系中的表达 确实产生了丝蛋白(例如ADF-3)，其可以以人工方式纺丝(spin)成"丝样" 的线，尽管在品质上仍旧很差。本专利技术人早期开发了用于在大肠杆菌(五.co/O中重组生产蜘蛛丝蛋25白的系统。例如，参考WO 2006/008163 (其要求美国临时申请号60/590,196 的优先权)。在这种表达系统中，单个结构单元(=组件)可以自由变化， 因此可以适合特别情形的需要。这种类型的组件还在Hiimmerich, D., Hdsen, C.W., Oschmann， J., Rudolph, R.禾口 Scheibel, T. (2004): "Primary structure elements of dragline silks and their contribution to protein solubility30and assembly (拖丝的丝的主要结构元件和它们对蛋白质溶解和装配的贡献),肠c/z簡勿(生物化学)43,13604-13612"中公开。特别关于蜘蛛丝蛋白在医药领域的应用的高度相关性的一个目的是 药物、蛋白、化学制品等与这些蜘蛛丝蛋白的共价偶联。然而，迄今为止， 尚未知令人满意的技术，所述技术一方面允许这些物质与蜘蛛丝蛋白以预5先确定的量偶联，并且另一方面，在所述蜘蛛丝蛋白内预先确定的位置偶联。因此，本专利技术的一个潜在的目的是提供一种制备修饰的蜘蛛丝蛋白的 方法，所述方法可以用于将物质如药物、金属、多肽、多糖、标记分子、量子点(quantum dots)、核酸、脂质等与这些蜘蛛丝蛋白靶向偶联。本发 10明的另一个目的是提供这样修饰的蜘蛛丝序列，其可以用于携带并且递送 精确量的这些物质，并且其中所述的这些物质在所述蜘蛛丝蛋白序列内预 先确定的位置偶联。这一 目的通过独立权利要求的主题而得以实现。优选的实施方案包含 在从属权利要求中。15 在这方面的主要兴趣是在蜘蛛丝分子中结合氨基酸，所述氨基酸具有化学上特殊的氨基酸侧链，在这种情形中为半胱氨酸的硫醇基或赖氨酸的 氨基。迄今为止已经描述的蜘蛛丝蛋白的上文提及的组件中没有一种包含 半胱氨酸或赖氨酸，因此，个别核酸序列的特异性诱变允许将需要的氨基 酸以可控方式结合到所述组件序列中。以这种方式修饰的组件可以装配成20新的构建体，因此，通过组合单一的组件，还可以将多于一种的化学活性 剂或药物组合在一种单一的构建体中。因此，试剂与重组蜘蛛丝蛋白的特异性多次偶联首次可行。除了基本 组件的修饰之外，另外存在通过TAGs方式将化学反应性氨基酸与现有的 构建体偶联以活化或修饰其的机会。25 如上文提及，本专利技术人自己产生与蜘蛛丝蛋白类似并且具有这样的特性的蛋白的有效生产方法，所述特性可以特异性地受到允许将单一 DNA 序列组件以可控方式装配到合成基因中的克隆策略的影响(Hiimmerich等, 2004)。所述单一组件不被外来DNA序列间隔，如同在现有技术克隆系统 中的情形。在目前所用的克隆系统中，例如，可以使用克隆载体pAZL(由 30本专利技术人研发)，其包含确定的克隆盒(附图说明图1)。这一克隆盒最重要的元件是两种限制性核酸内切酶(BseRI和Bsgl)的识别序列，所述其限制性位点 分别位于远离各自的识别序列8和14个核苷酸处。这允许翻译起点和终 止密码子的排列以及在合成基因之前或之后直接结合其它限制性位点。在BseRI和BsgI限制性位点之间，在克隆盒中存在间隔区，其将在 5 后续步骤中先被单一序列组件取代，并且而后被合成的基因取代。在所述 后续步骤中将保持所述单一元件的排列(参见图1)。形成本专利技术起点的单体序列组件的基础是蜘蛛十字园蛛的基因ADF3 和ADF4以及蜘蛛棒络新妇蛛(A^fe7ac/"v^^)的基因FLAG。所用ADF3 和ADF4序列的变化公众可用(在登记号U47855和U47856下本文档来自技高网...

【技术保护点】
修饰蜘蛛丝蛋白的方法，其包括步骤：　　　　ａ）提供编码不包含赖氨酸或半胱氨酸残基的蜘蛛丝蛋白或其片段或变体的核酸；　　　　ｂ）用编码赖氨酸或半胱氨酸的核酸序列取代编码所述蜘蛛丝蛋白中一个或多个氨基酸的核酸，或为所述序列加入含有编码赖氨酸和／或半胱氨酸的核酸的核酸序列；　　　　ｃ）在适当的宿主中表达在ｂ）中获得的修饰的核酸序列，和　　　　ｄ）回收所表达的修饰的蜘蛛丝蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：托马斯沙伊贝尔，
申请(专利权)人：慕尼黑技术大学，
类型：发明
国别省市：DE[德国]