修饰的人C3蛋白质制造技术

本发明专利技术提供了能形成稳定的Ｃ３转化酶的修饰的天然补体途径蛋白质。优选地，这些修饰蛋白质是修饰的人体Ｃ３蛋白质。本发明专利技术也提供了编码这些蛋白质的ＤＮＡ序列和ＤＮＡ构建体。本发明专利技术还提供了由这些蛋白质和特定的结合组分（如抗体）组成的缀合物以及这些蛋白质和／或缀合物在医疗上的用途。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及能形成稳定的C3转化酶(convertase)的新的修饰蛋白质和编码这些蛋白质的DNA序列，以及这些蛋白质作为治疗剂(特别是用于排除补体途径蛋白质水平的治疗剂)的用途。补体系统在人体和其它脊椎动物的免疫反应中起作用，在效应子功能如诱导局部炎症反应的细胞的吞噬作用、溶解细胞和募集现象中十分重要。这些特性对消除入侵的病原体(如细菌)是合乎需要的，但是当被触发对抗宿主组织(例如局部缺血后的重新灌流伤害)或者排斥外来的治疗物质(如异种移植中的超急排斥)时是不合乎需要的。有人试图通过开发补体调节蛋白质(其正常功能是抑制补体活化)的衍生物来消除这些不合乎需要的特征。补体系统包括在细胞表面(受体和调节因子)和在液相(血浆和其它胞外环境)中的蛋白质。产生反应的关键步骤是C3蛋白水解转化成C3b和C3a片段。C3a象C5a一样，是一种过敏毒素，能把肥大细胞吸引到攻击位点，导致局部组胺释放、血管舒张和其它炎症效果。新产生的C3b能够结合在其产生的位点周围的表面，然后C3b由溶细胞的补体成分(C5-C9)集中攻击。结合在表面的C3b，以及它的降解产物，也作为C3受体的配体起作用，调节例如吞噬作用。补体活化有两种有区别的途径，它们都导致C3转化成C3b以及随后的反应。经典途径一般由抗体和抗原复合物激发，引起涉及蛋白质C1q，C1r，C1s，C2和C4的酶级联反应。替代途径依赖一个活化环，涉及C3自身并需要因子B和因子D。C3向C3b(或C3i)转化产生的产物能与因子B结合，形成C3bB(或C3ib)。这些复合物经因子D作用产生C3bBb，它是一种C3转化酶，能够将更多的C3断裂成C3b，导致更多的C3bBb的形成，从而又有更多的C3转化。在一定的环境条件下，C3bBb复合物通过和正调节因子备解素(P)结合稳定化，然而这个正反馈环通常被调节蛋白质(最明显的是因子H和因子I)限制在很低的水平上。因子H(在结构上和细胞结合分子相关)(i)从C3b取代B和Bb，(ii)作为因子I(把C3b裂解成iC3b)的辅因子起作用，从而阻止与因子B的任何重组形成更多的C3转化酶。在有表面如许多细菌的细胞壁(它可与新生成的C3b结合，阻止它被因子H和因子I调节)存在时，途径被“引发”来扩大C3b的产生。新产生的C3b也能够和内源细胞结合，因而，通常露置于补体的内源细胞表面额外地受膜结合调节物如MCP，DAF和CR1的保护，所述调节物以与因子H相似的方式起作用。有少见的几种自然出现的状态，其中正常的液相调节不能进行，并且自发的C3转化最终导致C3在循环中普遍性耗竭(i)因子H或因子I的遗传缺损，(ii)和C3bBb结合并阻止解离的抗体(肾炎因子)的存在，(iii)与眼镜蛇毒中一种叫眼镜蛇毒因子(CVF)的蛋白质(其和因子B结合并形成C3转化酶，这种酶不包含C3b，也不受因子H和因子I的影响)相联系。这些情况说明在缺乏特异性活化时补体的负调节对正常生理活动有重要作用。也有特异性活化发生的情况，但这不是所希望的，特别是当它直接抵抗宿主组织(例如局部缺血或外伤伤害组织)或抵抗特意施用的有治疗用途的外部物质(如异种移植，人工器官或透析膜)时。补体活化导致不期望的攻击和进一步的损害。因此，在这些情况下，阻断和抑制活化和反应将是有益的。目前阻止补体介导损害的方法是使用负调节蛋白质(CR1，MCP，DA以及因子H和因子I)阻止补体活化。补体抑制剂(如因子I，因子H和膜结合蛋白质CR1，DAF，MCP的可溶性衍生物)确实抑制替代途径的液相扩大环路。因而，在模拟生理状态下，有人试图使用这些分子，特别是CR1(看来它是效力最强的)来减少补体介导的损害。内源的因子H以高浓度(典型的是0.3-0.5mg/ml)存在于血浆中。即使升高水平的抑制剂确实抑制液相反应，它们的效力也是微弱的，因此对活体用药就必须使用大量的纯化蛋白质(例如，可溶性的CR1的浓度可能超过5mg/kg体重)，另外，因子H的效应被抑制的表面可以活化替代途径。当它不一定伴随着其它抑制因子的活性减少时，同样的因子表明它们不可能完全或全面地发挥效力。眼镜蛇毒因子(CVF)有能产生稳定的C3转化酶的特性。C3转化酶在实验中可以排除动物体内的补体和其它体外样品(如人血浆)中的补体。CVF效力较高，(如40ug/kg就能破坏小鼠的补体活性)，然而它的缺点使它不适合作人体治疗。首先，它从眼镜蛇毒中获得(这个来源获取困难，操作危险)，因而必须很小心的从神经毒液中提纯出来，在供应方面有明显的困难。这个问题不可能通过很容易地通过克隆和基因的体外表达来克服，因为在眼镜蛇体内有翻译后的修饰(特异性蛋白质水解加工)，这种修饰要在体外完成是困难的(或是不可能的)。另外，这种加工所需的酶和酶切消化的条件在目前还是未知的。第二，蛋白质是属于外部来源的(对人而言)，因而是免疫原性的。这使它不能进行重复治疗。而在好几周内除去病人的补体是需要重复治疗的(如使异种移植成活)。尽管CVF和人体C3有一些结构和功能上的同源性，它与C3也有很大的差别(如链结构，生物合成位点，对补体调节因子的不敏感性，稳定的C3转化酶的形成)。它不能从C3的眼镜蛇等价物中获得，因为后者是已知的，已被克隆和测序，在大体结构和功能上与人体C3而不是CVF更相似。CVF是与人类在进化上距离很远的眼镜蛇的毒液中的特异性产物，因而使用基因操作把这个蛋白质修饰成可在人体非免疫原性地使用的产物是不可行的。现在，我们设计了一种替代策略，它主要依靠越过生理调节，而不是抑制补体活性来引起系统的过度活化。它有两方面的应用。首先，它可用来在体内活化补体直到一种或几种组分排除，导致人体失去对任何随后的攻击(如异种移植)产生局部反应的能力。第二，它可以把无法调节的过度活化特意地定位在一个特定的目标(如一种病毒或一种病毒感染的细胞)以增加目标对补体介导的破坏的敏感性。本文使用的术语“补体活化的调节因子”包括对C3转化的扩大有抑制作用的所有蛋白质，并不用来限制在那些基因定位在RCA基因座上的蛋白质。然而，它并不包括“正调节因子”如备解素。除非特别指出，“C3转化”是指C3蛋白质酶解转化成C3b和C3a，“C3转化酶”(或只是“转化酶”)是指催化这种反应的酶(典型的是两个或更多的蛋白质组分的复合物，如C3bBb，C3iBb，CVFBb或C4b2a)。这样，本专利技术的第一方面是提供一种修饰的天然补体途径蛋白质，其能形成稳定的C3转化酶。“天然”意指自然存在的，也就是说可从大自然中获得的。所述的定义包括上述的被修饰的天然存在的补体途径蛋白质，而无意于把它限制到特别的蛋白质种类。举例来说，一种修饰后的人体蛋白质在其它的动物种类中可被用作一种稳定的C3转化酶。典型情况下，使用从同一种类中得到的修饰补体途径蛋白质。对C3DNA编码序列的修饰(例如使用定位诱变)能产生C3的变异体，它能抗补体调节蛋白质，同时保留了有益的功能特性(用C3转化酶可裂解为C3b)和结构完整性的特征(正确的链结构，巯基酯键的存在)，本专利技术此处所述的是关于天然补体蛋白质(如人体C3)的遗传修饰形式，这种修饰形式的C3b片段获得了抵抗生理补体调节的特性。因为这种特性，在生理环境中(例如在活体内)，这些分子可以产本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能形成稳定的Ｃ３转化酶的修饰的天然补体途径蛋白质。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：RA哈里森，TC法里依斯，
申请(专利权)人：艾姆特兰有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]