负调节抗性C3转化酶制造技术

描述了天然补体途径蛋白质，这些蛋白质被修饰得能够形成负调节抗性Ｃ３转化酶，所说的修饰的蛋白质优选的是一种修饰的人类Ｃ３蛋白质。也提供了编码这些蛋白质的ＤＮＡ序列以及ＤＮＡ构建体。也描述了包含这些蛋白质和特异性结合部分的缀合体，例如抗体。同样也描述了这些蛋白质和／或缀合体在治疗中的用途。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种新的能够形成对负调节有抗性的C3转化酶的修饰蛋白质，编码这些蛋白质的DNA序列以及这些蛋白质作为治疗剂的用途，特别是在用于减少补体途径蛋白质水平或者在特异性位点上靶向补体攻击(C3b沉积)上的用途。补体系统在人类和其它脊椎动物的免疫应答中起作用，并且在效应功能诸如细胞吞噬、细胞溶解以及细胞反射增进方面是十分重要的，它引起局部炎症反应。这些性质对于除去侵入病原体(如细菌)是合乎需要的，但是当触发宿主组织(例如在后局部出血再灌注伤害)或者异治疗物质(例如异种抑制的超急性排斥)时不受欢迎的。通过利用补体抑制蛋白质以试图废除这些不受欢迎的性质的蛋白质，其正常的功能在于抑制补体活化。补体系统包含细胞表面的蛋白质(受体和调节物)以及液相(血浆和其它胞外环境)的蛋白质。用于产生应答关键的步骤是将C3的蛋白水解转化成为片段C3b和C3a。C3a是过敏毒素，它如同C5a一样吸引肥大细胞到攻击位点，导致组胺的局部释放、血管舒张和其它炎症反应。新生的C3b在它产生的位点周围具有表面结合能力。于是这种C3b集中在由溶细胞补体组分(C5-C9)产生的攻击上。例如，表面结合C3b和它的降解产物也作为C3受体介导吞噬作用的配体而起作用。补体活化有两条明显的途径，它们全都导致C3转化成为C3b和随后的应答。通常通过抗体与抗原的复合体触发典型的途径，该途径引起牵涉蛋白质Clq、Clr、Cls、C2以及C4的酶级联。可选择的途径取决于牵涉C3自身和所需因子B和D的活化环。C3转化为C3b(或者C3i)产生可以与因子B结合的产物，并且给出C3bB(或者C3iB)。这些复合体通过因子D起作用而产生C3bBb，该C3bBb是能够从C3b切除更多C3的C3转化酶，这将导致更多的C3bBb和更多的C3转化。在特定环境下，C3bBb复合物通过与正调节物备解素(P)缔合而是稳定的。然而，通常将这种正反馈环由调节蛋白质(显著地因子H和因子I)限制为一种缓慢的反转。因子H(和结构上相关细胞结合分子)(ⅰ)从C3b取代B和Bb，以及(ⅱ)充当因子I的辅因子，它通过抑制与因子B的任何重组切开C3b成为iC3b由此形成更多C3的转化酶。该途径用于扩增在表面上存在的C3b的世代，如许多细菌细胞壁，它们结合新生C3b，并且通过因子H和I抑制它的调节。也能够将新生C3b固定到内源性细胞上。因此，通过膜结合调节物(如MCP、DAF和CR1)附加地保护通常暴露于补体的内源性细胞表面，该调节物与因子H表现出一种类似的方式。具有一些稀有的天然存在的条件，其中不能产生正常的液相调节并且自发的C3转化最终导致从循环中C3的全身性衰竭-(ⅰ)因子H或I的遗传失调,(ⅱ)抗体的存在(肾因子)结合C3bBb，并且抑制解离，以及(ⅲ)在眼镜蛇毒液中与一种蛋白质相联系，称之为眼镜蛇毒毒因子(CVF)，它与因子B结合，并且形成C3转化酶，该酶不合有C3b，并且不受到因子H和I的影响。在缺少特异性活化的情况下，这表明补体负调节的正常生理重要性。也具有发生特异性活化的环境，但是不需要，特别是当它针对宿主组织(例如通过局部缺血或外科破坏的组织)时，或者针对为了治疗目的有意提供的异物(如异种移植物、人工器官或者透析膜)时。补体活化导致不合要求的侵袭并且进一步破坏，那么在这些情况下它对抑制或者抑制活化和应答将是有益的。抑制补体介导损伤的现有方法已将负调节蛋白质(CR1、MCP、DAF以及因子H和I)的运用作为目标以抑制补体活化。补体如同因子I、一样的抑制剂，因子H和膜结合蛋白质CR1、DAF、MCD的可溶性衍生物确实抑制可选择途径的液相扩增环。因此，利用这些分子的意图是在生理情况下减少补体介导的损伤，特别是CR1(看起来是最有效的)。因子H以高浓度(典型地0.3-0.5mg/ml)内源地存在血浆中，因此即使提高抑制剂的水平确实阻抑液相反应，那么它们的潜力很弱，于是在体内应施用大量的纯化蛋白质(例如可能超过可溶性CR1的5mg/Kg体量)。此外，通过表面已经抑制因子H的影响来活化可选择的途径。当没有必要伴随减少其它抑制剂的活性时，相同的因子表明它们不可能完全或者普遍有效。眼镜蛇毒液因子(CVF)具有产生一种稳定C3转化酶的性质，实验上该性质在动物体内中以及在其它样品的体外(例如人类血浆)可以用来减少补体。CVF是有效的(例如40μg/Kg可以破坏小鼠的补体活性)。然而在人类治疗上利用它却是不合适的。首先，从眼镜蛇毒液中获得以便处理(一个获得的困难来源和并且是危险的)，因此必须细心地从毒液神经毒素进行纯化。显然获得供给也是困难的。这个问题不能通过克隆和表达来自体内的基因容易地克服，因为具有后翻译修饰发生在蛇中(特异性蛋白水解加工)，这在体外产生可能是困难的(或者不可能的)。此外，要求这种加工的酶和消化条件是当前未知的。其次，蛋白质(对于人类)是外源的，因此是免疫的。这排除它的重复治疗的利用，正如要求将患者进行去补体许多周(例如使得可以异种移植存活)。虽然CVF与人类C3具有一些结构和功能的同源性，但是在这两方面都具有主要的区别(例如链结构，生物合成位点，补体调节物的非灵敏性，稳定C3转化酶的形成)。它不是来自已知的C3的眼镜蛇等同物，它已进行克隆与测序，并且它在总体结构和功能上比CVF更加类似人类C3。CVF是一种来自人类的大的进化距离的动物毒液特异性产物。因此利用基因操作将这种蛋白质修饰为在人类中可以用于非免疫原性的产物是不可以实施的。现在我们已设计一种可供选择的策略，该策略依赖于旁支生理调节；同时代替抑制补体活化，它导致超活化系统。这具有两项应用。首先，直到耗尽一个或多个组分时它在体内可以用于激活补体，导致丧失对任何随后攻击产生局部应答的能力(如异种移植)。其次，可以将非调节超活化故意地局限为一个特定的靶(例如病毒或者病毒感染的细胞)以增加那种靶对补体介导破坏性应答的灵敏度。这里所使用的术语“补体活化调节物”包括所有抑制C3转化扩增的蛋白质，并且不是指由于方法所限制的那些蛋白质，其基因位于RCA的基因座上。然而它不包括诸如备解素一类的“正调节物”。将“C3转化”定义为进入C3b和C3a的C3蛋白水解转化，除非另外提到的，并且将“C3转化酶”(或者简化为“转化酶”)定义为一种催化这种反应的酶(典型地两个或者更多个蛋白质组分的复合物；例如C3bBb、C3iBb、CVFBb或C4b2a)。这样，在第一个方面本专利技术提供了修饰(以便该蛋白质能够形成负调节抗性C3转化酶)的天然补体途径蛋白质。“天然的”意味着天然产生的，也就是说天然可以获得的。这样，该定义包括如上文所定义的任何已修饰的天然产生的补体途径蛋白质。它不被限定在物种特异性蛋白质。换句话说，例如一种修饰的人类蛋白质在其它哺乳动物中可以用作负调节抗性C3转化酶。典型地，将利用来自相同物种的修饰的补体途径蛋白质。C3 DNA编码序列的修饰(例如利用定点诱变)可以产生不同抗补体调节蛋白质的C3的变体，而保持正功能特性(通过C3酶对C3b的切割)和结构完整性特征(正确链结构，以及硫酯键的存在)。在这里所描述的本专利技术涉及天然补体蛋白质的基因修饰型，例如人类C3，它的C3b片段获得抗生理补体调节的性质。由于这种抗性，在生理环境本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种天然补体途径蛋白质，该蛋白质被修饰得能够形成负调节抗性Ｃ３转化酶。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：TC法里斯，RA哈里森，
申请(专利权)人：艾姆特兰有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]