本发明专利技术涉及一种检测基质金属蛋白酶-2的生物传感器的制备方法及应用，首先在96孔板上修饰胶体金，利用金-硫键的结合把一端含巯基另外一端含生物素的肽连接到胶体金-96孔板上。再制备出链霉亲和素-蔗糖转化酶-胶体金探针(streptavidin-转化酶-AuNPs)。通过生物素和亲和素的特异性结合，从而得到streptavidin-转化酶-AuNPs-肽修饰的96孔板(基质金属蛋白酶-2生物传感器)。MMP-2可以把含特异性序列PLGVR的肽切割成两部分，streptavidin-转化酶-AuNPs在上清液中，吸出上清液加入果糖溶液，根据血糖仪读数，从而实现MMP-2浓度的测定。本发明专利技术的传感器具有很高的选择性和检测灵敏度。
【技术实现步骤摘要】
—种检测基质金属蛋白酶-2的生物传感器的制备方法及其应用
本专利技术属于分析化学与生物传感器领域，具体为一种检测基质金属蛋白酶-2生物传感器的制备方法及其应用。另外，本专利技术还涉及所述的生物传感器检测基质金属蛋白酶-2的方法。
技术介绍
肿瘤浸润转移的过程是肿瘤细胞与宿主相互作用的多环节过程。肿瘤细胞分泌产生多种蛋白水解酶参与降解细胞外基质。基质金属蛋白酶是其中的主要酶类，基质金属蛋白酶是一个大家族，因其需要Ca2+、Zn2+等金属离子作为辅助因子而得名。基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-7(MMP-7)除可以降解IV型胶原外，还能降解V、YD型胶原及明胶，与肿瘤侵袭转移的关系最为密切。近年来，MMP-2的结构和功能得到了广泛、深入的研究。很多研究结果表明，MMP-2在多种疾病的病理进程中发挥着关键的作用。一些研究者根据实验结果指出，通过检测MMP-2可以估计这些疾病的病理进程，也就是MMP-2可以作为这些疾病的预后指标。据此，研制准确、灵敏、快速测定MMP-2、MMP-7活性的方法具有极高的医学应用价值。基质金属蛋白酶常用测定方法有酶联免疫吸附法(Patel, S.； Sumitra, G.；Koner, B.C.；Saxena, A.Clin.Biochem.2011, 44, 869-872);表面等离子共振法(Pieper-Fiirst, U.；Kleuser, U.； StocMeiE5 ff.F.M.；ffarsinke, A.；Scheller, F.ff.Anal.Biochem.2004, 332, 160-167)；凝胶电泳法(Barbosa, F Jr.；Gerlach, R.F.；Tanus-Santos,J.E.Basic Clin.Pharmaco1.Toxicol.2006,98,559-564.Yamane, T.；Mitsumata, M.；Yamaguchi, N.；Nakazawa, T.；Mochizuki, K.；Kondo, T.；Kawasaki, T.；Murata, S.；Yoshida, Y.;Katoh, R.Cell Tissue Res.2010，340，471-479)；突光法(Lefkowitz, R.B.; Schmi d_ Schonbein, G.ff.；He 11 er, M.J.Ana 1.Chem.2010，82，8251-8258);酶切割超磁性法(Zhao, M.Josephson, L.;Tang, Y.；ffeissleder, R.Angew.Chem., Int.Ed.2003, 42, 1375-1378);磁共振成像法(Harris, T.J.；von Maltzahn, G.；Derfus, A.M.；Ruoslahti, E.；Bhatia, S.N.Angew.Chem., Int.Ed.2006，45，3161-3165)和荧光共振能量转移法(Wang, Y.H.；Shen, P.；Li, C.Y.；ffang, Y.Y.；Liu, Z.H.Anal.Chem.2012, 84, 1466-1473)等。这些方法各有其优点，能不同程度的满足对基质金属蛋白酶-2的检测要求，但方法复杂，需要贵重的仪器，检测成本高。所以必须发展一种方法简单、成本低廉的新型检测方法。
技术实现思路
鉴于现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种检测基质金属蛋白酶-2的生物传感器的制备方法及应用，以及提供一种采用所述的生物传感器检测基质金属蛋白酶-2的方法。本专利技术的目的是这样实现的:一种检测基质金属蛋白酶-2的生物传感器的制备方法，包括如下步骤:(I)将100 μ L0.1?10 μ M肽溶液加到胶体金修饰的96孔板中，37°C反应12?60h，用Tris-HCl溶液冲洗各孔，得肽修饰胶体金_96孔板；(2)加10 μ L0.1?2mg/mL链霉亲和素溶液于转化酶-AuNPs (转化酶修饰胶体金)溶液中，置于恒温振荡器上震荡4?32h。然后以8000?14000转速下离心，将沉淀加ImLTris-HCl溶液分散,得链霉亲和素修饰转化酶胶体金(streptavidin-转化酶-AuNPs)；(3)取streptavidin-转化酶-AuNPs溶液加到肽修饰胶体金_96孔板中反应,之后用Tris-HCl溶液冲洗各孔，从而得基质金属蛋白酶-2生物传感器；其中:所述的胶体金修饰的96孔板按如下的方法制备而成:96孔板用无水乙醇和水依次超声处理3次，然后在37°C下干燥。将100 μ L胶体金溶液滴涂在处理好的96孔板中，在室温条件下使溶剂自然挥发，即得胶体金修饰96孔板(胶体金-96孔板)；所述的转化酶修饰胶体金按如下的方法制备而成:用NaOH溶液将胶体金溶液pH调至7.0，取0.2?2mL胶体金溶液于离心管中，然后加入500 μ L0.1?2mg/mL转化酶溶液，4°C反应2?12h，8000?14000转速下离心，并用PBS洗涤后分散于磷酸缓冲溶液中，即得；所述的肽的部分序列为CGHHYYGPLGVRGC-biotin。优选的，上述的生物传感器的制备方法，其中所述的金纳米粒子按如下方法制备而成:在圆底烧瓶中加入100mL、0.01 %的HAuCl4,搅拌加热至沸腾，然后快速加入1.8mL、I %的Na3C6H5O7,再加热、搅拌10分钟，冷却至室温，即得。一种利用上述方法制备的生物传感器检测基质金属蛋白酶-2含量的方法，使用不同浓度的基质金属蛋白酶-2加入基质金属蛋白酶-2生物传感器中，然后取出上清液于0.5mL小离心管中，准确加入100μ L、0.5mM蔗糖溶液，37°C下反应30?180分钟，用血糖仪检测生成葡萄糖含量，以血糖仪读数(Glucosemeters signal (mg/dL))为分析信号,进行基质金属蛋白酶-2的测定。由于上述方法制备的生物传感器可以检测基质金属蛋白酶_2，因此，本专利技术提供了上述的生物传感器在检测基质金属蛋白酶-2含量中的应用。与现有技术相比，本专利技术涉及的生物传感器具有如下优点和显著地进步:金纳米粒子提供相对大的比表面积用于负载转化酶，使得本专利技术设计的生物传感器具有高灵敏度。另外，根据实验血糖仪读数(图6)可以看出，当本专利技术的生物传感器用于检测MMP-1，MMP-2, BSA和IgG时，其血糖仪读数远远低于检测基质金属蛋白酶-2的血糖仪读数，这说明该生物传感器具有很高的选择性来检测基质金属蛋白酶_2。以胶体金修饰的96孔板为基质，通过肽链上的巯基和胶体金易于固定肽链，操作简单。其次，以血糖仪为检测仪器，操作简单、能够及时快速的提供定量的结果，检测仪器体积小、价格便宜，可便携。再者，以市场上价格便宜的96孔板为载体可以节约测定成本。因此，本专利技术涉及的生物传感器在构建检测蛋白质的研究方法中体现出良好的发展前景。【附图说明】图1检测基质金属蛋白酶-2的原理图。图2为肽切割溶液酸度对血糖仪读数的影响。图3为切割时间对血糖仪读数的影响。图4为探针的用量对血糖仪读数的影响。[0021 ] 图5为MMP-2标准曲线。横坐标为MMP-2浓度(C_p_2 (pg/mL))。图6方法选择性图本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测基质金属蛋白酶‑2的生物传感器的制备方法及其应用，包括以下步骤： (1)将100μL的0.1～10μM肽溶液加到胶体金修饰的96孔板中，37℃反应12～60h，用Tris‑HCl溶液冲洗各孔，得肽修饰胶体金‑96孔板； (2)加10μL的0.1～2mg/mL链霉亲和素溶液于转化酶‑AuNPs(转化酶修饰胶体金)溶液中，置于恒温振荡器上震荡4～32h；然后以8000～14000转速下离心，将沉淀加1mL Tris‑HCl溶液分散，得链霉亲和素修饰转化酶胶体金(streptavidin‑转化酶‑AuNPs)； (3)取streptavidin‑转化酶‑AuNPs溶液加到肽修饰胶体金‑96孔板中反应，之后用Tris‑HCl溶液冲洗各孔，从而得基质金属蛋白酶‑2生物传感器； 其中：所述的胶体金修饰的96孔板按如下的方法制备而成：96孔板用无水乙醇和水依次超声处理3次，然后在37℃下干燥；将100μL胶体金溶液滴涂在处理好的96孔板中，在室温条件下使溶剂自然挥发，即得胶体金修饰96孔板(胶体金‑96孔板)； 所述的转化酶修饰胶体金按如下的方法制备而成：用NaOH溶液将胶体金溶液pH调至7.0，取0.2～2mL胶体金溶液于离心管中，然后加入500μL0.1～2mg/mL转化酶溶液，4℃反应2～12h，8000～14000转速下离心，并用PBS洗涤后分散于磷酸缓冲溶液中，即得。...
【技术特征摘要】
1.一种检测基质金属蛋白酶-2的生物传感器的制备方法及其应用，包括以下步骤: (1)将100μ L的0.1?10 μ M肽溶液加到胶体金修饰的96孔板中，37 °C反应12?60h，用Tris-HCl溶液冲洗各孔，得肽修饰胶体金_96孔板； (2)加10μ L的0.1?2mg/mL链霉亲和素溶液于转化酶-AuNPs (转化酶修饰胶体金)溶液中，置于恒温振荡器上震荡4?32h ;然后以8000?14000转速下离心，将沉淀加ImLTris-HCl溶液分散,得链霉亲和素修饰转化酶胶体金(streptavidin-转化酶-AuNPs)； (3)取streptavidin-转化酶-AuNPs溶液加到肽修饰胶体金_96孔板中反应,之后用Tris-HCl溶液冲洗各孔，从而得基质金属蛋白酶-2生物传感器； 其中:所述的胶体金修饰的96孔板按如下的方法制备而成:96孔板用无水乙醇和水依次超声处理3次，然后在37°C下干燥；将100 μ L胶体金溶液滴涂在处理好的96孔板中，在室温条件下使溶剂自然挥发，即得胶体金修饰96孔板(胶体金-96孔板)； 所述的转化酶修饰胶体金按如下的方法制备而成:用NaOH溶液将胶体金溶液pH调至7.0，取0.2?2mL胶体金溶液于离心管中，然后加入500 μ L0.1?2mg/mL转化酶溶液，4°C反应2?...
【专利技术属性】
技术研发人员：混旭，柏莉，徐亚琼，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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