人激素原转化酶4制造技术

本发明专利技术提供新型人激素原转化酶４的多核苷酸和多肽。编码人激素原转化酶４的多核苷酸位于１９号染色体上，并可用于如鉴定与人类疾病状况相关的基因组区。本发明专利技术还包括生产这种蛋白质及其相应抗体的方法。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
许多以前体形式合成的蛋白质和激素均经过高度特异性的、属于激素原转化酶家族的蛋白酶加工而成为成熟形式。这一哺乳动物内切蛋白酶家族在它们的底物多肽中二碱性氨基酸位点的羧基侧进行胞内切割。此激素原转化酶(PC)家族的成员均为与酵母二碱性氨基酸特异性内切蛋白酶Kex2相关的Ca++依赖性丝氨酸蛋白酶(Smeekins，S.P.，Bio/Technology 11182-186，1993)。而且其催化区的构成与细菌性的枯草杆菌蛋白酶相似。至少已发现6种哺乳动物激素原转化酶PC2，PC3/PC1，PC4，PC5/6，弗林蛋白酶/成对碱性氨基酸切割酶(furin/PACE)和PACE4(Smeekins，S.P.，同出处，Seidah，N.G.等，Biochimie(France)76197-209，1994)。哺乳动物激素原转化酶作用于多种有生物学活性排列的前体分子。胰岛素原是第一个得到鉴定的底物前体。随后，从酵母到哺乳动物已发现超过150种底物；包括神经肽、肽激素、生长因子及其受体、血浆和凝固蛋白、逆转录病毒包膜蛋白和细胞毒素如碳疽。切割位点处包括碱性氨基酸，切割发生在成对的碱性残基处，通常在Lys-Arg或Arg-Arg之后，较少见在Arg-Lys或Lys-Lys之后(Smeekins，S.P.，同出处)。激素原转化酶家族有组织特异性表达和细胞区室化性质，这可能与生物学功能有关。例如，PC1/3和PC2只在神经内分泌组织中表达。这些蛋白质的生物学活性局限在神经内分泌细胞中、特别是分泌颗粒中受调节的分泌途径上；且这两种蛋白质均在颗粒中前体如胰高血糖素原，阿黑皮素原(POMC)和胰岛素原的加工过程中有重要作用。故，其胞内定位和组织特异性看来反映了这些内切蛋白酶显示其生物学活性的所在部位。PC4的基因表达有高特异性的组织选择性。PC4已从小鼠和大鼠中分离得到，且只表达于睾丸中。在小鼠体内，PC4基因表达发生在与精子发生第一阶段相应的妊娠第20天左右。在生殖细胞中发现有高水平的PC4m RNA表达，但在间质细胞(Leydig’s Cell)，足细胞(Sertoli’s Cell)或生精小管周围细胞(peritubular cell)中未有发现。原位杂交证实在粗线期精母细胞和圆精子细胞中有mRNA表达，但在延长的精子细胞中不表达(N.G.Seidah等，分子内分泌学，61559-1570，1992)。而且，在大鼠和小鼠中均发现三种PC4 mRNA；这些RNA可能是由于不同的剪接和/或外显子跳跃事件产生的。衍生自主要剪接形式或其它剪接形式的小鼠和大鼠PC4蛋白质的生物学功能尚不清楚。精子发生是发生在生精小管(生殖细胞或称精细胞在此最终成熟为精子)中的连续过程。睾丸中产生的肽均为介导睾丸细胞相互作用的潜在旁分泌因子和自分泌因子。大部分已知的这些潜在肽底物均产生于间质细胞和足细胞这些非生殖细胞中。位于生精小管中的足细胞与生殖细胞接触，并可能直接产生影响生殖细胞成熟的睾丸特异性因子。影响生殖细胞的其它因子可能是旁分泌因子或内分泌因子；产生于生精小管外的这些分子中大多数由足细胞表达的转运和结合蛋白运送进生殖细胞微环境中。此外，能穿过细胞屏障并进入精子细胞微环境的旁分泌因子包括间质细胞分泌的分子。间质细胞位于生精小管之间存在的胞间隙内，产生好几种可能在成熟过程中很重要的因子，如睾酮，间质因子(Leydig factor)，IGF-1，抑制素和prohibin。这些因子及其它因子可能在精子发生周期中的某一确定阶段内特异作用。而且，与足细胞十分接近的生殖细胞中表达的某些肽激素是潜在的介导睾丸细胞相互作用的旁分泌因子和自分泌因子。例如阿片样肽，POMC和脑啡肽原均在生殖细胞中表达并可能会被加工。有趣的是，鼠脑啡肽原的mRNA表达与精子发生期间鼠PC4的mRNA表达形式相似(S.Torii，等，FEBS Let.31612-16，1993)。鼠PC4的阶段特异性表达暗示它在加工睾丸的激素原因子的过程中有生物学作用。虽然推测PC4在精子发生中有作用，但PC4的功能实际上并不清楚。因此要寻找人类同系物。本专利技术便利地提供了鼠PC4的人类同系物的分离。专利技术概要本专利技术提供了编码人激素原转化酶4多肽的分离多核苷酸，该多肽所含的一段氨基酸序列至少90％等同于选自下组的氨基酸序列(a)SEQ ID No2所示114位氨基酸(Ser)至443位氨基酸(Ala)的氨基酸序列；(b)SEQ ID No2所示114位氨基酸(Ser)至755位氨基酸(Thr)的氨基酸序列；(c)SEQ ID No2所示20位氨基酸(Arg)至755位氨基酸(Thr)的氨基酸序列；及(d)SEQ ID No2所示1位氨基酸(Met)至755位氨基酸(Thr)的氨基酸序列。在另一个实施方案中，上文公开的分离的人激素原转化酶4多核苷酸选自下组(a)SEQ ID No1所示400位至1389位核苷酸的多核苷酸序列；(b)SEQ ID No1所示400-2325位核苷酸的多核苷酸序列；(c)SEQ ID No1所示118-2325位核苷酸的多核苷酸序列；及(d)SEQ ID No1所示61-2325位核苷酸的多核苷酸序列。在另一个实施方案中，上文公开的分离的人激素原转化酶4多核苷酸包含SEQ ID No3所示1-2265位核苷酸。在另一个实施方案中，上述分离的人激素原转化酶4多核苷酸编码的人激素原转化酶4多肽基本上由至少90％等同于SEQ ID No2所示20位(Arg)-755位(Thr)氨基酸序列的氨基酸残基序列组成。在另一个实施方案中，上述分离的多核苷酸编码的人激素原转化酶4多肽基本上由SEQ IDNo2所示20位(Arg)-755位(Thr)氨基酸残基的序列组成。第二方面，本专利技术提供含有以下可操作连接在一起的元件的表达载体转录启动子；编码至少90％等同于SEQ ID No2中20位(Arg)-755位(Thr)所示氨基酸序列的激素原转化酶多肽的DNA区段；转录终止子。在另一实施方案中，上述表达载体进一步包含与该DNA区段可操作连接的分泌信号序列。第三方面，本专利技术提供已导入上述表达载体的培养细胞，其中所述细胞表达该DNA区段编码的多肽。另一方面，本专利技术提供编码融合蛋白的DNA构建体，该DNA构建体包含至少90％等同于选自下组之氨基酸残基序列的多肽的第一DNA编码区段(a)SEQ ID No2中1位(Met)-21位(Pro)残基的氨基酸序列；(b)SEQ ID No2中20位(Arg)至113位(Arg)残基的氨基酸序列；(c)SEQ ID No2中114位(Ser)-443位(Ala)残基的氨基酸序列；(d)SEQ ID No2中444位(Arg)-561位(Tyr)残基的氨基酸序列；(e)SEQ ID No2中562位(Tyr)-755位(Thr)残基的氨基酸序列；(f)SEQ ID No2中114位(Ser)-755位(Thr)残基的氨基酸序列；(g)SEQ ID No2中20位(Arg)-755位(Thr)残基的氨基酸序列；以及另含编码额外多肽的至少一个其它DNA区段，其中该第一DNA区段和该其它DNA区段读框一致地连接，并编码融合蛋白。另一实施方案中本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码包含与选自下组之氨基酸序列至少９０％相同的一段氨基酸残基序列的人激素原转化酶４多肽的分离多核苷酸：（ａ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２所示１１４位（Ｓｅｒ）至４４３位（Ａｌａ）氨基酸的氨基酸序列；（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２所示１１４位 （Ｓｅｒ）至７５５位（Ｔｈｒ）氨基酸的氨基酸序列；（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２所示２０位（Ａｒｇ）至７５５位（Ｔｈｒ）氨基酸的氨基酸序列；和（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ：２所示１位（Ｍｅｔ）至７５５位（Ｔｈｒ）氨基酸的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：S罗克，SR加斯比斯，
申请(专利权)人：津莫吉尼蒂克斯公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]