本发明专利技术公开了一种海马血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，特点是包括脱脂海马粉制备步骤；将脱脂海马粉依次用胰蛋白酶和碱性蛋白酶酶解后，过滤得到海马蛋白酶解液；将海马蛋白酶解液用超滤膜进行超滤收集分子量大于20KDa的滤液，并进行浓缩和冷冻干燥得到海马蛋白粉的步骤；最后将海马蛋白粉与水混合后加入木瓜蛋白酶进行酶解，将酶解液沸水灭活离心后，取沉淀冷冻干燥即得到海马ACE抑制肽粉末，最近依次采用Sephadex G-15凝胶过滤、反相高效液相色谱法进行分离纯化，收集高活性组分即可，优点是工艺简单、操作方便且本法制备多肽水解度高，多肽片段分子量较小，活性高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及一种血管紧张素转化酶抑制肤的制备方法，尤其是设及一种海马血管 紧张素转化酶抑制肤的制备方法。
技术介绍
海马又叫水马、海狗子、马头鱼、龙落子等，为介类硬骨鱼，在分类上属于鱼纲、海 龙目、海龙科、海马属的海产鱼类。海马种类较多，分布较广，目前已知的有35种。一般多 分布于热带、亚热带的近陆浅海海藻、海草生长丰富的海域中。分布于我国沿海附近的常见 海马有：S斑海马（化切fri曲aci/ia加SLeach)、大海马（度左化/a Bleeker)、日本 海马（度知公〇打ic化？Kaup)、刺海马（度Ai別rix Kaup)和线纹海马（度知心邸知化rdan et Snyder)。在中国，海马是一种名贵的中药材，有很多功效，被人们称为"南方人参"。据 《本草纲目》记录，海马具"主难产及血气痛，暖水脏，壮阳道，消瘤块，治疗疮肿痛"等功效。 在我国海马的药用价值历史悠久，梁代陶弘景在《本草经集注》中已有海马药用的记载，而 欧洲18世纪开始也将海马入药。目前海马在医药上的主要功能有：用于阳瘦、不育、哮喘、 虚烦不眠、腰腿痛、铁打损伤、外伤出血、腹痛、难产、乳腺癌、瘤块等。 据测定，海马中蛋白质含量占海马干重的67. 9-73. 56%，各类氨基酸含量比较均 衡，对海马蛋白进行酶解制备生物活性肤具有重要的意义。生物活性肤是蛋白质中20个 天然氨基酸W不同组成和排列方式构成的从二肤到复杂的线性、环形结构的不同肤类的总 称，是源于蛋白质的多功能化合物。活性肤在自然界中是广泛存在的，没有肤，就没有活性， 就没有生命。现代营养学研究发现：人类摄食蛋白质经消化道的酶作用后，大多是W低肤形 式消化吸收的，W游离氨基酸形式吸收的比例很小；进一步试验掲示肤比游离氨基酸消化 更快、吸收更多，表明肤的生物效价和营养价值比游离氨基酸更高。活性肤具有多种人体代 谢和生理调节功能，易消化吸收，有促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作 用，食用安全性极高，是当前国际食品界最热口的研究课题和极具发展前景的功能因子。由 于生物活性肤具有运些特殊的功能，使得人们对活性肤的需求量急剧增加，目前，已有许多 活性肤应用在保健和医疗上。 血管紧张素转化酶抑制肤是一类具有抑制血管紧张素转化酶(ACE)活性的多肤物 质。运类多肤由于其有降血压的功能，所W又称为降血压肤。血管紧张素转化酶抑制剂（ACE I)根据来源可分为天然和人工合成两大类，目前临床上使用的ACEI都是人工合成的。运 类药物的作用机理是作为竞争性抑制剂与ACE结合，从而扰乱血管紧张素II的生成。人工 合成类高血压药物对人体会产生一定的负作用，如咳嗽、皮肤痊痒、味觉素乱及血压过度降 低等。因此，天然血管紧张素转化酶抑制肤是今后研究与发展趋势之一。海洋拥有特殊的 生态环境，赋予了海洋生物异于陆生生物所特有的化学成分和结构，具有特异的高活性、高 药效。近年来对海洋药物的研究越发深入，越来越多的研究发现生物活性肤具有很好的医 疗保健功效，具有抗肿瘤、抗氧化、降血压、抗疲劳、增强免疫力等活性。而海马是重要的中 药材，因此利用海马蛋白来开发ACE抑制肤具有重要的药用价值。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种工艺简单、操作方便且本法制备多肤水解 度高，多肤片段分子量较小、活性高的海马血管紧张素转化酶抑制肤的制备方法。 本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种海马血管紧张素转化酶抑制 肤的制备方法，包括W下步骤： (1) 海马前处理：将海马洗净冻好后，于-80 °C下冷冻干燥48h，再用粉碎机粉碎，然 后采用C〇2超临界流体萃取技术脱除脂肪酸，得到脱脂海马粉； (2) 海马蛋白液制备：将步骤（1)得到的脱脂海马粉与水按40-60g/L的比例混合后，依 次用膜蛋白酶和碱性蛋白酶酶解后，用滤纸过滤取上清液，即为海马蛋白酶解液；将海马蛋 白酶解液用截留分子量为20KDa的超滤膜进行超滤，收集分子量大于20KDa的滤液，并进行 浓缩和冷冻干燥得到海马蛋白粉； (3)ACE抑制肤制备：将步骤（2)中得到的海马蛋白粉与水按400-600g/L的比例混合 后，加入海马蛋白粉质量5%的木瓜蛋白酶进行酶解，酶解溫度为59 °C，时间为7.5h，pH 为7. 7,将酶解液沸水灭活10分钟后，于4000巧m离屯、10min,取沉淀冷冻干燥即得到海 马ACE抑制肤粉末； (4)ACE抑制肤纯化：采用Se地adexG-15凝胶过滤对步骤（3)制备得到的ACE抑制肤 粉末进行分离纯化，上样量2mL，ACE抑制肤粉末浓度为0. 05g/mU洗脱速度1. 0mL/min， 3血/管，收集PH-I3、PH-I4和PH-I5S个组分；采用反相高效液相色谱法分别对PH-I3、 PH-I4和PH-I5S个组分进行分离纯化，设置A相为含有体积百分数0. 1%S氣乙酸的水 溶液，B相为含有体积百分数0. 1% =氣乙酸的乙腊溶液进行梯度洗脱，检测波长为220nm， 其中PH-I3的洗脱条件为0-35min，0-32%B相，流速为1血/min,收集组分PH-I3-5 ;PH-I4 的洗脱条件为〇-l〇min，100%A相；10-40min，0-24%B相，流速为1血/min,收集组分 PH-I4-3 ;PH-I5的洗脱条件为0-40min，0-35%B相，流速为0. 8血/min,收集组分PH-I5-3， 合并PH-I3-5、PH-I4-3和PH-I5-3S个组分，冷冻干燥，即得到高活性的ACE抑制肤粉末。 步骤（1)中所述的C〇2超临界萃取技术进行脱脂的条件为：萃取溫度为58°C、萃取 压强为35MPa、静态萃取lOmin后调节C02流量为15LA、动态萃取时间为125min的萃取条 件下对海马骨粉进行脱脂。 步骤（2)中所述的膜蛋白酶的酶解条件为溫度45 °C、时间4h、pH8. 8、添加质量 为脱脂海马粉的4%;碱性蛋白酶酶解溫度54. 70°C、时间6h、pH9.0、添加质量为脱脂海马 粉的为4〇/〇。 所述的海马包括大海马、=斑海马、线纹海马、日本海马、刺海马。 与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术首次公开了一种海马血管紧张素转 化酶抑制肤的制备方法，其利用木瓜蛋白酶酶解海马蛋白制备ACE抑制肤省时、高效，且工 艺简单、操作方便、仪器设备要求低，能耗小，避免化学方法制备多肤过程中的残留和污染， 且本法制备多肤水解度高，多肤片段分子量较小，更有利人体小肠的吸收。酶解后ACE抑制 肤的ICso为2. 028 + 0.llOmg/mL，木瓜蛋白酶的ACE的半抑制浓度明显小于其它的蛋白酶， 说明木瓜蛋白酶的酶解产物具有较好的降血压功能。通过响应面法对木瓜蛋白酶进行水解 条件的优化，W达到海马蛋白最优的水解条件，在最优的酶解条件下，得到多肤ACE的半抑 制浓度ICs。为1. 997±0. 094mg/血。经进一步分离纯化后活性大幅提高，最强活性C5。值为 75. 93 + 3. 59jig/mL。【附图说明】 图1为添加量对木瓜蛋白酶酶解效果的影响； 图2为酶解时间对木瓜蛋白酶酶解效果的影响； 图3为酶解PH对木瓜蛋白酶酶解效果的影响； 图4为酶解溫度对木瓜蛋白酶酶解效果的影响； 图5本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种海马血管紧张素转化酶抑制肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）海马前处理：将海马洗净冻好后，于‑80 ℃下冷冻干燥48 h，再用粉碎机粉碎，然后采用CO2超临界流体萃取技术脱除脂肪酸，得到脱脂海马粉；（2）海马蛋白液制备：将步骤（1）得到的脱脂海马粉与水按40‑60g/L的比例混合后，依次用胰蛋白酶和碱性蛋白酶酶解后，用滤纸过滤取上清液，即为海马蛋白酶解液；将海马蛋白酶解液用截留分子量为20KDa的超滤膜进行超滤，收集分子量大于20KDa的滤液，并进行浓缩和冷冻干燥得到海马蛋白粉； （3）ACE抑制肽制备：将步骤（2）中得到的海马蛋白粉与水按400‑600g/L的比例混合后，加入海马蛋白粉质量5%的木瓜蛋白酶进行酶解，酶解温度为59 ℃，时间为7.5 h，pH为7.7，将酶解液沸水灭活10分钟后，于4000 rpm离心10 min，取沉淀冷冻干燥即得到海马ACE抑制肽粉末； （4）ACE抑制肽纯化：采用Sephadex G‑15凝胶过滤对步骤（3）制备得到的ACE抑制肽粉末进行分离纯化，上样量2mL，ACE抑制肽粉末浓度为0.05g/mL，洗脱速度1.0 mL/min，3 mL/管，收集PH‑I3、PH‑I4和PH‑I5 三个组分；采用反相高效液相色谱法分别对PH‑I3、PH‑I4和PH‑I5 三个组分进行分离纯化，设置A相为含有体积百分数0.1% 三氟乙酸的水溶液，B相为含有体积百分数0.1% 三氟乙酸的乙腈溶液进行梯度洗脱，检测波长为220nm，其中PH‑I3的洗脱条件为0‑35min，0‑32% B相，流速为1mL/min，收集组分PH‑I3‑5；PH‑I4的洗脱条件为0‑10min，100% A相；10‑40 min，0‑24% B相，流速为1mL/min，收集组分PH‑I4‑3；PH‑I5的洗脱条件为0‑40 min，0‑35% B相，流速为0.8mL/min，收集组分PH‑I5‑3，合并PH‑I3‑5、PH‑I4‑3和PH‑I5‑3三个组分，冷冻干燥，即得到高活性的ACE抑制肽粉末。...
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐永健，顾伟，黄娣，史筱莉，牟金婷，宿宇婷，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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