用于选择性修饰蛋白质的方法技术

总的来说，本发明专利技术涉及对蛋白质引入性质修饰基团的新方法。具体地，本发明专利技术涉及赖氨酸残基的衍生，以及具有改良的药理学性质的生长激素的新缀合物，和用于其制备和在治疗中使用的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
总的来说，本专利技术涉及对蛋白质引入性质修饰基团的新方法。具体地，本专利技术涉及赖氨酸残基的衍生，以及具有改良的药理学性质的生长激素的新缀合物，和用于其制备和 在治疗中使用的方法。
技术介绍
众所周知通过使基团与蛋白质缀合修饰蛋白质的性质和特征，以改变蛋白质的性 质。事实上，超过20年前，美国专利号4，179，337教导了与聚乙二醇或聚丙二醇缀合的蛋 白质。一般地，此种缀合一般需要蛋白质中的某一官能团以与缀合基团中的另一种官能团 反应。一般地，氨基例如N末端氨基或在赖氨酸中的ε-基团，已与合适的酰化试剂组合使 用。经常希望或甚至需要能够控制缀合反应，即控制缀合化合物在何处附着且控制附着多 少个缀合基团。这经常称为特异性或选择性。然而，选择性化学反应谱(r印ertoire)非常有限。替代方案是通过重组方法引入 具有独特反应性的特定非天然氨基酸，并且随后在进一步的衍生中利用这种反应性。替代 方案是使用识别待修饰蛋白质的结构和功能特征的酶。这个的例子是微生物转谷氨酰胺酶 (mTGase)的使用，以选择性修饰生长激素中的Gln残基。具体地，转谷氨酰胺酶已在食品工 业且特别在乳制品厂工业中用于交叉结合蛋白质。其他文件公开了转谷氨酰胺酶改变生理 学活性蛋白质的性质的用途。参见例如EP950665，EP 785276和Sato，Adv. Drug Delivery Rev.，54,487-504(2002)，其公开了在转谷氨酰胺酶的存在下在包括至少一个Gln的蛋 白质和氨基官能化PEG或相似配体之间的直接反应；还参见Wada在Biotech. Lett.，23， 1367-1372(2001)中，其公开了借助于转谷氨酰胺酶β -乳球蛋白与脂肪酸的直接缀合。通 过转谷氨酰胺酶催化的反应是其中谷氨酰胺残基的伯酰胺(primary amide)从反应混合物 中存在的伯胺转化成仲酰胺的转酰胺基反应，如附图说明图1中所示。然而，蛋白质的选择性衍生是非常困难的任务；蛋白质中的赖氨酸通过酰化进行 衍生是甚至更加固有的非选择性过程。因此，目前不存在用于赖氨酸残基选择性衍生的有 效方法。因此，本领域中迫切需要用于选择性衍生蛋白质或目的多肽中的氨基酸残基例如 赖氨酸的方法。附图简述图1描述了通过TGase催化的一般反应。图2描述了本专利技术的一般反应，也称为“反向TGase”。图3描述了如实施例1中所述的人生长激素的修饰。图4详细描述了 TGase介导的转酰胺基作用的机制。专利技术详述本专利技术通过提供这样的方法解决了这些需要，所述方法经由辅助蛋白质以更选择 性的方式将性质修饰基团引入靶蛋白质中，同时使用常规化学方法。一般而言该方法可 以如下描述首先，形成辅助蛋白质和性质修饰基团之间的活化复合物；其次，以比通过常 规方法可以达到的那种更加选择性的方式，将修饰基团从活化复合物转移到待修饰的蛋白质，且从而导致“修饰的蛋白质”。同样，如本文所使用的，“修饰的蛋白质”指已通过本专利技术的方法选择性修饰的蛋白质或多肽。具体地，本专利技术涉及包括含至少2个赖氨酸的蛋白质与性质修饰基团的转谷氨酰胺酶催化的反应的方法。性质修饰基团是式Rl-Gln-Gly-R2的含谷氨酰胺-甘氨酸的蛋白 质。具体地，在这个方法中，通过使性质修饰基团中的谷氨酰胺残基与TGase反应形成活化 酰基复合物，以附着性质修饰基团。在优选实施方案中，性质修饰基团通过酰化转移给靶蛋 白质中的赖氨酸残基，如图2中所述。在一个实施方案中，Rl和R2都是所需取代基，其中 至少一个包括适合于进一步修饰的化学基团。因此，本专利技术涉及“反向”TGase反应，以选择 性修饰在靶蛋白质内的赖氨酸残基。如本文所使用的，术语“多肽，，指通过肽键连接的氨基酸残基聚合物，无论是天然 还是合成产生的。小于约10个氨基酸残基的多肽通常称为“肽”。术语“肽”意指通过肽键 连接的2个或更多氨基酸的序列，其中所述氨基酸可以是天然或非天然的。该术语包含术 语多肽和蛋白质，这可以由通过共价相互作用或非共价相互作用结合在一起的2个或更多 肽组成，所述共价相互作用例如半胱氨酸桥。“蛋白质”是包括一条或多条多肽链的大分子。 蛋白质还可以包括非肽组分，例如碳水化合物基团。碳水化合物和其他非肽取代基通过其 中产生蛋白质的细胞可以加入蛋白质中，并且将随着细胞类型而改变。蛋白质在本文中就 其氨基酸主链结构而言进行定义；取代基例如碳水化合物基团一般并未指定，但仍可以存 在。由非宿主DNA分子编码的蛋白质或多肽是“异源”蛋白质或多肽。“分离的多肽”是基 本上不含在自然界中与多肽结合的污染细胞组分的多肽，所述污染细胞组分例如碳水化合 物、脂质或其他蛋白质杂质。一般地，分离的多肽制剂包含高度纯化形式的多肽，即至少约 80%纯、至少约90%纯、至少约95%纯、超过95%纯，例如96%、97%或98%或更高纯，或超 过99%纯。显示具体蛋白质制剂包含分离的多肽的一种方法是通过在蛋白质制剂的十二烷 基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳和凝胶的考马斯亮蓝染色后单个条带的出现。然而， 术语“分离的”不排除可选择的物理形式的相同多肽的存在，例如二聚体或可选择地糖基化 或衍生形式。术语“氨基末端”和“羧基末端”在本文中用于指在多肽内的位置。当上下文 允许时，这些术语关于多肽的特定序列或部分用于指接近或相对位置。例如，置于多肽内的 参考序列羧基末端的特定序列定位接近于参考序列的羧基末端，但不一定在完整多肽的羧 基末端处。本专利技术的辅助蛋白质本专利技术的一个方面涉及使用辅助蛋白质用于选择性修饰靶蛋白质的方法。在优选 实施方案中，辅助蛋白质是酶例如转谷氨酰胺酶。转谷氨酰胺酶(在本文中也可互换地称 为“TGase”)也称为蛋白质-谷氨酰胺-Y -谷氨酰转移酶，并且催化蛋白质或蛋白质链中 的谷氨酰胺(Gln)残基的Y-羧酰胺基(carboxyamido)和赖氨酸(Lys)残基的氨基或 各种烷基胺之间的酰基转移反应，如图1中所示。TGase在各种动物组织、血细胞、血浆等中 以各种分子形式广泛发现。这种酶催化通过 -( Y-谷氨酰)赖氨酸-同工蛋白质键的交 联反应，和在血液凝固的最后一个步骤中交联血纤蛋白分子，并且发现它涉及表皮细胞的 角质化、精液凝固、创伤组织愈合等。因为转谷氨酰胺酶对Gln残基具有非常高的底物特异 性，所以可能仅在蛋白质中的特定Gln残基可以用烷基胺修饰。例如，使用源于豚鼠肝脏的 转谷氨酰胺酶(TGase)，将具有末端糖单位的烷基胺引入β _酪蛋白内的其一个或多个特定 Gln 残基处(Yan, S. C. B.等人，(1984) Biochemistry，23，3759-3765)。此外，使用血液 凝固因子XIII (因子XIII)——在血浆中发现的转谷氨酰胺酶，将更低分子量的精胺衍生 物引入载脂蛋白B内的其一个或多个Gln残基处(Cocuzzi,E.等人，(1990), Biochem. J., 265,707-713)。在本专利技术的方法中使用的转谷氨酰胺酶可以得自各种来源，无具体限制， 例如得自各种动物组织、血浆组分和微生物。有用的转谷氨酰胺酶的例子包括微生 物转谷氨酰胺酶，例如来自茂原链霉菌(Str印tomyces mobaraense)、肉桂链霉菌 (St本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于蛋白质的位点选择性修饰的方法，所述方法包括：使所述蛋白质与辅助蛋白质和具有下式的性质修饰基团接触：Ｒ１－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｒ２。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：J布查特，N兰格兰约翰森，
申请(专利权)人：诺沃诺迪斯克有限公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]