检测植物花器官特异性DNA甲基化修饰位点的方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种检测植物花器官特异性DNA甲基化修饰位点的方法及试剂盒。其中，包括以下步骤：S1，提取植物花器官基因组DNA；S2，对植物花器官基因组DNA进行酶切；S3，分别对酶切产物连接上限制性内切酶的接头；S4，以接头为模板设计的预扩增引物进行PCR预扩增，得PCR预扩增产物；S5，将PCR预扩增产物稀释后，加入带有选择性碱基的筛选引物进行PCR扩增；S6，电泳检测PCR扩增产物，统计并分析DNA条带，S7，回收、克隆S6中得到的DNA甲基化差异条带并进行测序。采用本发明专利技术提供的接头、预扩增引物和筛选引物，能够稳定、高效地检测植物花器官特异性DNA甲基化修饰位点。

【技术实现步骤摘要】
检测植物花器官特异性DNA甲基化修饰位点的方法及试剂 合 Sl
本专利技术涉及分子生物学
，具体而言，涉及一种检测植物花器官特异性DNA 甲基化修饰位点的方法及试剂盒。
技术介绍
DNA甲基化在植物发育过程以及基因组防御环境因子胁迫等方面扮演重要的作用 (Leijak-Levanic et al. 2004; Ruiz-Garcia et al. 2005; Teyssier et al. 2008; Verhoeven et al. 2010)。在植物中，DNA甲基化通常发生在CpG或者CpNpG序列上，并且在DNA修复 的循环中可以维持不变(Wassenegger2000)。所有的植物发育过程都建立在精准的时空特 异表达和基因表达调控的基础之上。越来越多的证据表明基因表达的时空特异性不仅由特 异的DNA序列(顺式以及反式作用元件控制)调控，还由一些表观修饰因子，其中最主要的就 是DNA甲基化（Chan et al. 2005)进行调控。 目前，对基因组甲基化进行研究最常用的技术是甲基敏感扩增多态性技术 (Methylation sensi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测植物花器官特异性DNA甲基化修饰位点的方法，其特征在于，采用MSAP技术检测DNA甲基化，包括以下步骤：S1，提取植物花器官基因组DNA；S2，分别用Msp I/EcoRI和Hpa II/EcoRI两组酶对所述植物花器官基因组DNA进行酶切；S3，分别对酶切产物连接上限制性内切酶的接头；S4，以所述接头为模板设计的预扩增引物进行PCR预扩增，得PCR预扩增产物；S5，将所述PCR预扩增产物稀释后，加入带有选择性碱基的筛选引物进行PCR扩增；S6，电泳检测PCR扩增产物，统计并分析DNA条带，S7，回收、克隆所述S6中得到的DNA甲基化差异条带并进行测序，所述接头包括EcoRI接头和Hp...

【技术特征摘要】
1. 一种检测植物花器官特异性DNA甲基化修饰位点的方法，其特征在于，采用MSAP技 术检测DNA甲基化，包括以下步骤： S1，提取植物花器官基因组DNA ; 52, 分别用Msp I/EcoRI和Hpa II/EcoRI两组酶对所述植物花器官基因组DNA进行酶 切； 53, 分别对酶切产物连接上限制性内切酶的接头； 54, 以所述接头为模板设计的预扩增引物进行PCR预扩增，得PCR预扩增产物； 55, 将所述PCR预扩增产物稀释后，加入带有选择性碱基的筛选引物进行PCR扩增； 56, 电泳检测PCR扩增产物，统计并分析DNA条带， 57, 回收、克隆所述S6中得到的DNA甲基化差异条带并进行测序， 所述接头包括EcoRI接头和Hpall/MspI接头，所述EcoRI接头的序列为SEQ ID NO : 1 和 SEQ ID N0:2,所述 Hpall/MspI 接头的序列为 SEQ ID N0:3 和 SEQ ID N0:4;所述预 扩增引物包括EcoRI预扩增引物和Hpall/MspI预扩增引物，所述EcoRI预扩增引物的序列 为SEQ ID N0:5,所述Hpall/MspI预扩增引物的序列为SEQ ID N0:6;所述筛选引物包括 EcoRI筛选引物和Hpall/MspI筛选引物，所述EcoRI筛选引物序列为SEQ IDN0 :7?16,所 述Hpall/MspI筛选引物序列为SEQ ID NO :17?27。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S2中采用的酶切体系为20 μ 1酶切 体系，包括 10Χ 扩增缓冲液2· 0μ 1，DNA4. 0μ l，EcoRI/HpaII3U/3. 2U或EcoRI/MspI3U/4U， EcoRI 接头 0· 5 μ 1，Hpall/MspI 接头 0· 5 μ 1，T4 连接酶 0· 5 μ 1，ddH2011· 85 μ 1。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S4中的预扩增体系为25 μ 1体系，包 括稀释100倍的所述酶切产物2. 5 μ 1，浓度为10 μ mol/L的所述预扩增引物19. 5 μ 1，10Χ 扩增缓冲液2. 5 μ 1。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S4中的预扩增程序为94°C变性 211^11，941：变性3〇8,561：退火3〇8,721：延伸8〇8,30个循环，最后721：延伸51^11。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S5中的选择扩增体系为20 μ 1扩增 体系，包括PCR扩增混合液10 μ 1，稀释100倍的所述PCR预扩增产物3 μ l，HpaII/MspI引 物1μ l，EcoRI引物1μ 1，(ΜΗ205 μ 1，其中，所述PCR扩增混合液包括ddH20155. 0 μ 1，10X 扩增缓冲液40. 0 μ 1，5U Taq DNA聚合酶5 μ 1。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S5中的选择扩增程序为94°C变性 5min，94°C变性30s，65°C且每个循环退火温度降0. 7°C退火30s，72°C延伸lmin，13个循环 后；94°C变性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 80s，23 个循环，72°C延伸 5min。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述筛选引物的组合分别为：SEQ ID NO: 9+SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :9+SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :9+SEQ ID NO :24、SEQ ID NO : 12+SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :12+SEQ ID NO :18、SEQ ...

【专利技术属性】
技术研发人员：张德强，宋跃朋，马开峰，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11