本发明专利技术公开了一种亨廷顿蛋白的酰基化修饰方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）获取重组蛋白Htt（1-90）：a、亨廷顿蛋白基因的获得；b、重组表达质粒pTWIN1-htt的构建；c、表达亨廷顿蛋白的重组大肠杆菌菌株DH5α-htt的构建；d、重组蛋白的表达；（2）重组蛋白Htt（1-90）的纯化；（3）SPPS方法获得酰基化修饰的Htt（Cys-K92-K158）多肽；（4）Htt（Cys-K92-K158）多肽的纯化；（5）Htt（Cys-K92-K158）多肽与重组蛋白Htt（1-90）经过偶联获得经酰基化修饰目的蛋白Htt（1-158）；（6）经酰基化修饰目的蛋白Htt（1-158）的纯化。通过对亨廷顿蛋白的酰基化化学修饰，乙酰化处理后的蛋白水解程度较小，而非乙酰化蛋白水解程度较大，即说明了乙酰化修饰后的亨廷顿蛋白稳定性较强。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种蛋白质的化学修饰，具体涉及一种。
技术介绍
蛋白质修饰是一个复杂的过程，在真核生物中修饰类型很多，常见的有糖基化、乙酰化、泛素化、磷酸化和SUMO化，蛋白质修饰能够改变蛋白质的活性、定位或功能。蛋白质中的乙酰化修饰能够调控蛋白的多种性质，包括DNA-蛋白质相互作用、亚细胞定位、转录活性和蛋白质稳定性等。乙酰化的蛋白质具有能够高抵抗氨基肽酶和泛素依赖蛋白酶降解的能力。研究表明，在扩大的多谷氨酰胺诱导疾病中，蛋白的乙酰化和去乙酰化的失衡是一个关键过程。亨廷顿舞蹈病(Huntington disease,HD)是一种常染色体显性遗传的神经变性疾病，如基因编码一个由3144个氨基酸组成的亨廷顿蛋白(Huntingtin，Htt)，从Htt氨基酸末端第17位开始有一段重复的谷氨酰胺(CAG)序列。随着多聚谷氨酰胺的过度延长，Htt蛋白会在转谷氨酰胺酶的作用下发生交联而形成聚集体，在主链和侧链酰胺基之间氢键连接的作用下，多聚谷氨酰胺序列可形成多聚物，称为多聚谷氨酰胺序列(PolyQ)。正常人的PolyQ长度小于35个，而HD患者的PolyQ长度会超过37个。这些异常蛋白质积聚成块，损坏部分脑细胞，特别是那些与肌肉控制有关的细胞，导致患者神经系统逐渐退化，神经冲动弥散，动作失调，出现不可控制的颤搐，并能发展成痴呆，甚至死亡。临床表现主要为舞蹈样不自主动作、精神障碍和进行性痴呆。赖氨酸的乙酰化是一种可逆的蛋白质后修饰，并且在基因表达中有重要的调控作用，尤其是组蛋白的乙酰化对机体影响更大。乙酰化主要有三种形式，N-乙酰化、C-端的酰胺化和多肽侧链酰基化，酰基化多肽改变了多肽的电荷分布，对多肽和蛋白的周期、生物活性和稳定性有重要影响，同时乙酰化与对泛素化、磷酸化有竞争性作用。由于亨廷顿蛋白易于凝聚等，基于亨廷顿蛋白的发病机制，研究其乙酰化对亨廷顿疾病有指导性意义。没有修饰的亨廷顿蛋白显示出比较容易凝聚等，目前国内还没有研究所或者机构对亨廷顿蛋白进行化学修饰，通过对亨廷顿蛋白的酰基化化学修饰，乙酰化处理后的蛋白水解程度较小，而非乙酰化 蛋白水解程度较大，即说明了乙酰化修饰后的亨廷顿蛋白稳定性较强。
技术实现思路
针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种，经过乙酰化处理后的蛋白质，出峰时间延长，同时吸收峰强度有一定的变化，水解酶处理24h后，经过乙酰化处理后的蛋白水解程度较小，而非乙酰化蛋白水解程度较大，处理48h后，经过乙酰化处理后的蛋白与24h相比只有少量蛋白水解，而非乙酰化水解程度较大，有多个片段产生，即说明了乙酰化修饰后的亨廷顿蛋白稳定性较强。本专利技术的目的可通过下列技术方案来实现:一种，包括以下步骤:(1)、获取重组蛋白Htt (1-90):a、亨廷顿蛋白基因的获得；b、重组表达质SpTWINl-Aii的构建；c、表达亨廷顿蛋白的重组大肠杆菌菌株DH5a-htt的构建；d、重组蛋白的表达；(2)、重组蛋白Htt (1-90)的纯化；(3)、SPPS方法获得酰基化修饰的Htt(Cys-K92-K158)多肽；(4) Htt (Cys_K92_K158)多肽的纯化；(5) Htt (Cys_K92_K158)多肽与重组蛋白Htt (1-90)经过偶联获得经酰基化修饰目的蛋白Htt (1-158); (6)经酰基化修饰目的蛋白Htt (1-158)的纯化。作为优选,所述步骤(1)中:a、亨廷顿蛋白基因的获得:以质粒pcDNA3.1/mys-His为模板，设计合成含有I和I限制酶切位点的上下游引物Pl和P2，PCR扩增Aii基因片段，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后回收，纯化处理后与载体pMDlS-T连接，转入大肠杆菌JM109中，通过氨苄青霉素抗性筛选，得到重组质粒pMD18T-Aii，送至上海生工生物工程有限公司测序。将验证后的重组质粒用I和I双酶切处理，酶切产物纯化处理后置4°C冰箱保存；b、重组表达质粒pTWINl-htt的构建:将原核表达载体pTWINl和重组质粒pMD18T-htt分别用限制性内切酶EcoR I和Pst I双酶切，纯化处理后将线性pTWINl质粒片段和htt基因片段进行连接，转化大肠杆菌JM109中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行酶切鉴定和测序分析验证，所得重组质粒命名为pTWINl-htt ;c、表达亨廷顿蛋白的重组大肠杆菌菌株DH5 a -htt的构建:采用电转化法将重组质粒pTWINl-htt转化入大肠杆菌DH5 α感受态细胞中，利用氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，得到重组菌，命名为:DH5a-htt ;d、重组蛋白的表达:将重组菌DH5a-htt接种至LB液体培养基，置37°C摇床过夜培养。吸取过夜培养菌体以5%接种量接种LB液体培养基，37°C摇床培养至0D600=0.5^0.7，然后置20°C摇床培养加入lmmol/L的IPTG诱导表达目的蛋白4~6h,离心收集菌体。在40mmol/L的TRIS_Acetate、5mmol/L pH=8.3的溶液中进行超声破碎。通过离心(23000Xg，30 min, 40C)将细胞碎片和上清液分离，得到重组蛋白 Htt (1-90)。进一步地，所述的步骤(3)中合成酰基化修饰的Htt (Cys-K92-K158)多肽过程分为三个片段合成:a、首先合成Cys-S138-K158片段；b、再合成CyS-E110_L136片段；C、最后合成Cys-K92-1108片段；d、每个片段通过自然化学连接NCL或EPL方法连接得到Htt(Cys-K92-K158)多肽。进一步地，即所述步骤(3)中酰基化修饰位于亨廷顿外显子2或外显子3区域，即K92位点、K98位点、K99位点、K125位点、K155位点、K158位点中的至少一个位点。进一步地,合成Cys-S138_K158片段所用的固相载体是wang —树脂。进一步地，合成Cys-K92-1108片段和CyS-E110_L136片段所用的固相载体是N-酰基-苯并咪唑酮树脂。经酰基化修饰的亨廷顿蛋白与野生型亨廷顿蛋白比较，具有以下优点:经过乙酰化处理后的蛋白质，出峰时间延长，同时吸收峰强度有一定的变化，水解酶处理24h后，经过乙酰化处理后的蛋白水解程度较小，而非乙酰化蛋白水解程度较大，处理48h后，经过乙酰化处理后的蛋白与24h相比只有少量蛋白水解，而非乙酰化水解程度较大，有多个片段产生，即说明了乙酰化修饰后的亨廷顿蛋白稳定性较强。【附图说明】图1为获得Httl-90重组蛋白的流程图； 图2为SPPS方法获得酰基化的Htt (Cys-K92-K158)蛋白流程图； 图3为经酰基化修饰的目的蛋白Htt (1-158)的合成流程图； 图4:A为Htt (Cys-K92-K158)蛋白序列和合成片段； B为Htt (Cys-K92-K158)多肽酰基化修饰位点； 图5:A为未经过水解酶处理的乙酰化蛋白的色谱图； B为未经过水解酶处理的非乙酰化蛋白的色谱图； 图6:A为经水解酶处理24h的乙酰化蛋白的色谱图； B为经过水解酶处理24h的非乙酰化蛋白的色谱图； 图7:A为经水解酶处理48h的乙酰化亨廷顿蛋白的色谱图； B为经水解酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种亨廷顿蛋白的棕榈化修饰方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）、获取重组蛋白Htt（1?90）：a、亨廷顿蛋白基因的获得；b、重组表达质粒pTWIN1?htt的构建；c、表达亨廷顿蛋白的重组大肠杆菌菌株DH5α?htt的构建；d、重组蛋白的表达；（2）、重组蛋白Htt（1?90）的纯化；（3）、SPPS方法获得棕榈化修饰的Htt（Cys?K92?K158）多肽；（4）Htt（Cys?K92?K158）多肽的纯化；（5）Htt（Cys?K92?K158）多肽与重组蛋白Htt（1?90）经过偶联获得经棕榈化修饰目的蛋白Htt（1?158）；（6）经棕榈化修饰目的蛋白Htt（1?158）的纯化。
【技术特征摘要】
1.一种亨廷顿蛋白的棕榈化修饰方法，其特征在于，包括以下步骤:(1)、获取重组蛋白Htt (1-90):a、亨廷顿蛋白基因的获得；b、重组表达质粒pTWINl-Α--的构建；c、表达亨廷顿蛋白的重组大肠杆菌菌株DH5a -htt的构建；d、重组蛋白的表达；(2)、重组蛋白Htt (1-90)的纯化；(3),SPPS方法获得棕榈化修饰的Htt (Cys-K92_K158)多肽；(4) Htt(Cys-K92-K158)多肽的纯化；(5) Htt (Cys-K92_K158)多肽与重组蛋白 Htt (1-90)经过偶联获得经棕榈化修饰目的蛋白Htt (1-158)； (6)经棕榈化修饰目的蛋白Htt (1-158)的纯化。2.根据权利要求1所述的亨廷顿蛋白的棕榈化修饰方法，其特征在于，所述步骤(1)中:a、亨廷顿蛋白基因的获得:设计含有I和I限制酶切位点的上下游引物Pl和P2，从质粒pcDNA3.1/mys-His上采用PCR的方法扩增亨廷顿蛋白基因片段，将所扩增的htt基因片段和克隆载体pMDlS-Τ载体链接，得到重组质粒，转入大肠杆菌JM109中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行酶切鉴定和测序分析验证，所得重组质粒命名为pMD18T-Aii ;b、重组表达质粒pTWINl-htt的构建:将原核表达载体pTWINl和重组质粒pMD18T-Aii分别用限制性内切酶I和I双酶切，纯化处理后将线性pTWINl质粒片段和Aii基因片段进行连接，转化大肠杆菌JM109中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行酶切鉴定和测序分析验证，所得重组质粒命名为pTWINl-Α-- ;c、表达亨廷顿蛋白的重组大肠杆菌菌株的构建:采用电转化...
【专利技术属性】
技术研发人员：王喆明，
申请(专利权)人：杭州璞题生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。