亨廷顿病相关蛋白ｐｏｌｙＱ的体外聚集模型的建立方法技术

本发明专利技术为一种亨廷顿病相关蛋白ｐｏｌｙＱ的体外聚集模型的建立方法，包括如下步骤：构建ＧＳＴ－ｐｏｌｙＱ（Ｑ３６－Ｑ５５）融合蛋白表达载体；将该表达载体在表达菌中表达ＧＳＴ－ｐｏｌｙＱ（Ｑ３６－Ｑ５５）融合蛋白；将表达产物通过亲和层析纯化获得ＧＳＴ－ｐｏｌｙＱ（Ｑ３６－Ｑ５５）融合蛋白；将ＧＳＴ－ｐｏｌｙＱ（Ｑ３６－Ｑ５５）融合蛋白用蛋白酶酶切去除ＧＳＴ标签，获得ｐｏｌｙＱ多肽，冷冻干燥；制备ｐｏｌｙＱ多肽溶液；将ｐｏｌｙＱ多肽溶液在ｐＨ６．５－７．８的ＰＢＳ中或Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ中进行聚集反应，使用Ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎ?Ｔ检测其聚集过程。本发明专利技术构建的模型可以用于抗亨廷顿病活性物质的筛选及动力学研究。与人工合成的ｐｏｌｙＱ多肽相比较，可大大降低其筛选成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基因工程领域，尤其涉及一种亨廷顿病相关蛋白polyQ的体外聚集模型的建立方法。
技术介绍
亨廷顿病(Huntington’s Disease，HD)是一种常染色体显性遗传性神经退行性疾病，主要发生在中老年人群，患者的行为能力和认知水平障碍。亨廷顿病是由HD基因突变，即HD基因第一外显子中编码多聚谷氨酰胺的CAG重复序列异常扩增，其表达产物一亨廷顿蛋白(huntingtin，Htt)氨基端的多聚谷氨酰胺(简称“PolyQ”)异常延伸，PolyQ长度超出一定阈值，Q＞35(即Q的数量＞35)，表达产物(Htt蛋白)发生异常聚集，从而对神经元产生毒性而发病。正常的Htt蛋白弥散分布在神经元胞质内。在HD患者和HD动物模型的脑组织(或神经元)内，突变的Htt蛋白聚集成淀粉样斑块或形成包涵体。PolyQ长度与患者发病年龄相关。PolyQ在正常人群中短于35个，而在HD患者中突变Htt的谷氨酞胺长度超过36个(参见：Davies SW，TurmaineM，Cuzens，HA，at al.Formation of neuronal intranuclear inclusions本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种亨廷顿病相关蛋白polyQ的体外聚集模型的建立方法，其特征在于包括如下顺序的步骤：(1)构建GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白表达载体：所述GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白是在polyQ多肽序列的N端加有GST标签，polyQ长度为Q36-Q55，所述GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白表达载体是包含有编码GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白的核苷酸序列的表达载体；(2)所述GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白表达载体在表达菌BL21star中表达GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白；(3)将上一步所得表达产物通过亲和层析纯化获得GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白；(4)将GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白用蛋白酶酶切去除GST标签，获得polyQ多肽，冷冻干燥；(5)制备polyQ多肽溶液：向polyQ多肽冻干粉中加入六氟异丙醇和三氟乙酸混合液，溶解polyQ多肽，然后用氮气吹干有机溶剂，再加入pH值为3的三氟乙酸或二甲基亚砜，使polyQ多肽重新溶解，获得polyQ多肽溶液；(6)将polyQ多肽溶液在pH6.5-7.8的磷酸盐缓冲液中或三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液中进行聚集反应，使用硫代黄素T检测其聚集过程。2.根据权利要求1所述的亨廷顿病相关蛋白polyQ的体外聚集模型的建立方法，其特征在于所述GST-polyQ(Q36-Q55)融合蛋白表达载体的构建方法如下：以包含有编码EGFP-polyQ(Q36-Q55)蛋白的核苷酸序列的大肠杆菌重组质粒pET28a/EGFP-polyQ(Q36-Q55)为模板，利用PCR方法扩增polyQ(Q36-Q55)基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑易之，李冉辉，刘国宝，刘昀，邹永东，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：94