本发明专利技术公开了一种亨廷顿蛋白的棕榈化修饰方法，包括以下步骤：（1）、获取重组蛋白Htt（1-90）：a、亨廷顿蛋白基因的获得；b、重组表达质粒pTWIN1-htt的构建；c、表达亨廷顿蛋白的重组大肠杆菌菌株DH5α-htt的构建；d、重组蛋白的表达；（2）、重组蛋白Htt（1-90）的纯化；（3）、SPPS方法获得棕榈化修饰的Htt（Cys-K92-K158）多肽；（4）Htt（Cys-K92-K158）多肽的纯化；（5）Htt（Cys-K92-K158）多肽与重组蛋白Htt（1-90）经过偶联获得经棕榈化修饰目的蛋白Htt（1-158）；（6）经棕榈化修饰目的蛋白Htt（1-158）的纯化。通过对亨廷顿蛋白的棕榈化修饰，显示出蛋白的稳定性增加，棕榈化蛋白有对抗水解酶的能力，显示出棕榈化蛋白有较强的稳定性，因此研究亨廷顿蛋白的棕榈化对亨廷顿疾病的治疗有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种蛋白质的化学修饰，具体涉及一种。
技术介绍
蛋白质修饰是一个复杂的过程，在真核生物中修饰类型很多，常见的有棕榈化、乙酰化、泛素化、磷酸化和SUMO化，蛋白质修饰能够改变蛋白质的活性、定位或功能。蛋白质的棕榈化修饰是指16个碳的脂肪酸棕榈酸盐通过硫酯键共价结合到蛋白质特定的半胱氨酸残基侧链上，这对不同膜蛋白及膜蛋白信号通路的功能调节非常重要。 亨廷顿舞蹈病(Huntington disease,HD)是一种常染色体显性遗传的神经变性疾病，HD基因编码一个由3144个氨基酸组成的亨廷顿蛋白(Huntingtin，Htt)，从Htt氨基酸末端第17位开始有一段重复的谷氨酰胺(CAG)序列。CAG重复序列将产生两个直接结果:一是使野生型亨廷顿蛋白(wild huntingtin, wHtt)缺失,二是产生突变型亨廷顿蛋白(mutant Htt,mHtt)。随着多聚谷氨酰胺的过度延长,Htt蛋白会在转谷氨酰胺酶的作用下发生交联而形成聚集体，在主链和侧链酰胺基之间氢键连接的作用下，多聚谷氨酰胺序列可形成多聚物，称为多聚谷氨酰胺序列(PolyQ)。正常人的PolyQ长度小于35个，而HD患者的PolyQ长度会超过37个。这些异常蛋白质积聚成块，损坏部分脑细胞，特别是那些与肌肉控制有关的细胞，导致患者神经系统逐渐退化，神经冲动弥散，动作失调，出现不可控制的颤搐，并能发展成痴呆，甚至死亡。临床表现主要为舞蹈样不自主动作、精神障碍和进行性痴呆。Htt的214位半胱氨酸可由位于高尔基体的棕榈酰转移酶相关蛋白14(HIP14)棕榈酰化。HIP14的过量表达会导致内源性Htt的重新分配，并且能够在一定程度上将mHtt也分配到质膜中，而没有被棕榈酰化的Htt不能被重新分配，这种现象表明Htt重新分配到质膜是由棕榈酰化作用来调节的。相反，当PolyQ中的Htt棕榈酰化位点突变从而没有棕榈酰化时加剧了其细胞毒性,致使蛋白聚合和细胞死亡。
技术实现思路
针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种，通过对亨廷顿蛋白的棕榈化修饰，主要是Ser和Thr的O-连接棕榈化，显示出蛋白的稳定性增加，棕榈化蛋白有对抗水解酶的能力，显示出棕榈化蛋白有较强的稳定性，因此研究亨廷顿蛋白的棕榈化对亨廷顿疾病的治疗有重要意义。本专利技术的目的可通过下列技术方案来实现:一种，包括以下步骤:(1)、获取重组蛋白Htt (1-90):a、亨廷顿蛋白基因的获得；b、重组表达质SpTWINl-Aii的构建；c、表达亨廷顿蛋白的重组大肠杆菌菌株DH5a-htt的构建；d、重组蛋白的表达；(2)、重组蛋白Htt (1-90)的纯化；(3)、SPPS方法获得棕榈化修饰的Htt(Cys-K92-K158)多肽；(4) Htt (Cys_K92_K158)多肽的纯化；(5) Htt (Cys_K92_K158)多肽与重组蛋白Htt (1-90)经过偶联获得经棕榈化修饰目的蛋白Htt (1-158); (6)经棕榈化修饰目的蛋白Htt (1-158)的纯化。作为优选，所述步骤(1)中:a、亨廷顿蛋白基因的获得:设计含有I和I限制酶切位点的上下游引物Pl和P2，从质粒pcDNA3.1/mys-His上采用PCR的方法扩增亨廷顿蛋白基因片段，将所扩增的Aii基因片段和克隆载体pMDlS-T载体链接，得到重组质粒，转入大肠杆菌JM109中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行酶切鉴定和测序分析验证，所得重组质粒命名为pMD18T-Aii ;b、重组表达质粒pTWINl-htt的构建:将原核表达载体pTWINl和重组质粒pMD18T-Aii分别用限制性内切酶I和Pst I双酶切，纯化处理后将线性pTWINl质粒片段和Aii基因片段进行连接，转化大肠杆菌JM109中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行酶切鉴定和测序分析验证,所得重组质粒命名为pTWINl-Α-- ;c、表达亨廷顿蛋白的重组大肠杆菌菌株的构建:采用电转化法将重组质粒pTWINl-Α--转化入大肠杆菌DH5 α感受态细胞中，利用氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，得到重组菌，命名为:DH5 a -htt ;d、重组蛋白的表达:将重组菌DH5 a -htt接种至LB液体培养基，置37°C摇床过夜培养，吸取过夜培养菌体以5%接种量接种LB液体培养基，37°C摇床培养至0D600=0.5^0.7，然后置20°C摇床培养加入lmmol/L的IPTG诱导表达目的蛋白4~6h,离心收集菌体,在40mmol/L的TRIS-Acetate、5mmol/L pH=8.3的溶液中进行超声破碎，通过离心(23000 X g，30min，40°C)将细胞碎片和上清液分离。 进一步地，所述的步骤(3)中合成Htt (Cys-K92_K158)多肽的过程分为三个片段合成:a、首先合成Cys-S138-K158片段；b、再合成Cys-E110-L136片段；C、最后合成Cys-K92-1108片段；d、每个片段通过自然化学连接NCL或EPL方法连接得到Htt(Cys-K92-K158)多肽。进一步地，所述步骤(3)中棕榈化修饰位于亨廷顿外显子2或外显子3区域，即C105位点、C109位点、C137位点、C152位点中的至少一个位点。进一步地,合成Cys-K92-1108片段所用的固相载体是wang —树脂。进一步地，合成Cys-E110-L136片段和Cys-S138_K158片段所用的固相载体是N-酰基-苯并咪唑酮树脂。经棕榈化修饰的亨廷顿蛋白与野生型亨廷顿蛋白比较，具有以下优点:通过对亨廷顿蛋白的棕榈化修饰，主要是Ser和Thr的O-连接棕榈化，显示出蛋白的稳定性增加，棕榈化蛋白有对抗水解酶的能力，显示出棕榈化蛋白有较强的稳定性，因此研究亨廷顿蛋白的棕榈化对亨廷顿疾病的治疗有重要意义。【附图说明】图1为获得Httl-90重组蛋白的流程图； 图2为S95位点棕榈化修饰的Htt (Cys-K92-K158)多肽合成示意图； 图3为经棕榈化修饰目的蛋白Htt (1-158)的合成流程图； 图4:A为HttCys-K92-K158蛋白序列和合成片段； B为Htt (Cys-K92-K158)多肽棕榈化修饰位点； 图5:A为棕榈化修饰亨廷顿蛋白的反相色谱图；B为非棕榈化亨廷顿蛋白的反相色谱图； 图6:A为经棕榈化修饰亨廷顿蛋白水解后的反相色谱图； B为未经棕榈化修饰亨廷顿蛋白水解后的反相色谱图； 图7为棕榈化修饰和非棕榈化修饰蛋白水解后免疫印迹分析显影图。其中I为天然Htt蛋白；2为掠桐化修饰后Htt蛋白；3为蛋白酶水解天然Htt蛋白；4为蛋白酶水解棕榈化修饰后Htt蛋白。具体实施例实施例1:获得重组蛋白Httl-90 一)试验材料 (I)载体和菌株 质粒pcDNA3.Ι/mys-His由CHDI惠赠；表达载体pTWINl购自NEB公司；质粒pMD18_T和大肠杆菌JM109、DH5a购自Takara生物科技有限公司。(2)弓丨物Pl:5-CCGGAATTCCTGCCGTGCC-3 (EcoR I)P2:5-AAAACTGCAGACAGCCGGGC-3 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种亨廷顿蛋白的棕榈化修饰方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）、获取重组蛋白Htt（1?90）：a、亨廷顿蛋白基因的获得；b、重组表达质粒pTWIN1?htt的构建；c、表达亨廷顿蛋白的重组大肠杆菌菌株DH5α?htt的构建；d、重组蛋白的表达；（2）、重组蛋白Htt（1?90）的纯化；（3）、SPPS方法获得棕榈化修饰的Htt（Cys?K92?K158）多肽；（4）Htt（Cys?K92?K158）多肽的纯化；（5）Htt（Cys?K92?K158）多肽与重组蛋白Htt（1?90）经过偶联获得经棕榈化修饰目的蛋白Htt（1?158）；（6）经棕榈化修饰目的蛋白Htt（1?158）的纯化。
【技术特征摘要】
1.一种亨廷顿蛋白的棕榈化修饰方法，其特征在于，包括以下步骤:(1)、获取重组蛋白Htt (1-90):a、亨廷顿蛋白基因的获得；b、重组表达质粒pTWINl-Α--的构建；c、表达亨廷顿蛋白的重组大肠杆菌菌株DH5a -htt的构建；d、重组蛋白的表达；(2)、重组蛋白Htt (1-90)的纯化；(3),SPPS方法获得棕榈化修饰的Htt (Cys-K92_K158)多肽；(4) Htt(Cys-K92-K158)多肽的纯化；(5) Htt (Cys-K92_K158)多肽与重组蛋白 Htt (1-90)经过偶联获得经棕榈化修饰目的蛋白Htt (1-158)； (6)经棕榈化修饰目的蛋白Htt (1-158)的纯化。2.根据权利要求1所述的亨廷顿蛋白的棕榈化修饰方法，其特征在于，所述步骤(1)中:a、亨廷顿蛋白基因的获得:设计含有I和I限制酶切位点的上下游引物Pl和P2，从质粒pcDNA3.1/mys-His上采用PCR的方法扩增亨廷顿蛋白基因片段，将所扩增的htt基因片段和克隆载体pMDlS-Τ载体链接，得到重组质粒，转入大肠杆菌JM109中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行酶切鉴定和测序分析验证，所得重组质粒命名为pMD18T-Aii ;b、重组表达质粒pTWINl-htt的构建:将原核表达载体pTWINl和重组质粒pMD18T-Aii分别用限制性内切酶I和I双酶切，纯化处理后将线性pTWINl质粒片段和Aii基因片段进行连接，转化大肠杆菌JM109中，经过氨苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆子，提取质粒并进行酶切鉴定和测序分析验证，所得重组质粒命名为pTWINl-Α-- ;c、表达亨廷顿蛋白的重组大肠杆菌菌株的构建:采用电转化...
【专利技术属性】
技术研发人员：王喆明，
申请(专利权)人：杭州璞题生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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