用于结直肠癌早期诊断的无创甲基化定量检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及疾病相关DNA检测技术领域，更具体地，涉及结直肠癌受试者早期血浆DNA中rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843基因的特定区域甲基化实时定量检测试剂盒。所述定量检测试剂盒是通过PCR引物及Taqman探针来完成检测的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及疾病相关DNA检测
，更具体地，涉及结直肠癌受试者早期血浆DNA中rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843基因的特定区域甲基化实时定量检测试剂盒。
技术介绍
结直肠癌是世界上第三大恶性肿瘤，近年来中国结肠癌发病率由7％激增到13％。结直肠癌发病与生活方式、遗传、大肠腺瘤等关系密切，且发病年龄趋老年化。结直肠癌早期症状不明显，仅感不适、消化不良、大便潜血等。目前的血肿瘤标记物如癌胚抗原检测，有助于肿瘤的诊断。此外，结肠镜检查可以检查结肠和直肠肠腔，并在检查过程中进行活检和治疗。尽管活体组织检查对结直肠癌的早期癌变和息肉癌变的确诊有决定性意义，但其侵入性的操作限制了在人群中进行结直肠癌的早发普查。此外，脱落细胞学检查尽管准确性高，但其取材繁琐，且不易获得满意的标本，临床应用较少。DNA甲基化是一种表观遗传学修饰，大量研究表明DNA甲基化的异常变化可引起基因组染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。因此，表观遗传学改变在肿瘤形成和发展过程中发挥着重要作用。近年来研究表明，DNA异常甲基化状态与结直肠癌的发生发展密切相关，同时也有多个基因的异常高甲基化在结直肠癌中频繁发生。因此，DNA异常甲基化有望作为结直肠癌早期诊断的生物标志物。循环DNA是指肿瘤细胞在增殖、转移和凋亡过程中不断释放进入血浆或血清中的游离DNA。研究人员在多种恶性肿瘤患者的血清或血浆中发现了甲基化的游离DNA。荧光定量PCR是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，能实时监控反应过程，并结合相应的软件进行产物分析的PCR技术。该方法较其他传统甲基化检测方法在时间上大幅缩减，同时，可以对极微量的DNA基因水平上的改变进行检测和定量，解决血浆中DNA含量少、丢失率高、DNA降解、带有致癌污染物等缺陷，
使肿瘤抑制基因启动子的高甲基化在癌症患者的血浆中检测出来。因此，实时定量检测肿瘤患者中血浆游离DNA的表观遗传变化对肿瘤的早期诊断、疗效评估、发生机制等研究具有重要意义，更加适合医院或科研院所操作。目前，对血浆游离DNA中基因的异常甲基化检测已成为肿瘤分子诊断学中无创诊断的一个新的研究热点。本项目开发计划采用分析早期结直肠癌患者血浆或血清中游离DNA的核糖体RNA假基因(rRNA pseudogene)、HECT结构域泛素蛋白链接酶1(HECT domain containing E3ubiquitin protein ligase1，HECTD1)和锌指蛋白843(zinc finger protein 843，ZNF843)基因启动子区的甲基化程度，结合现代的生物信息技术和统计学原理，提供操作简便、灵敏度高、周期短、检结果稳定可靠的甲基化定量检测方法，同时为患者的治疗随访和预后提供科学依据。rRNA pseudogene是一类与编码基因高度相似但不能表达功能蛋白质的细胞内非编码基因。过去的研究认为假基因是没有功能的DNA片段，然而随着分子生物学技术的发展，人们从测序数据中发现在肿瘤转录组中有大量假基因表达，这些假基因的表达不仅具有癌症特异性，还具有组织特异性。因此，越来越多的证据表明，假基因在人类癌症等疾病方面扮演着重要的角色。而该基因的甲基化水平异常可能影响基因的转录表达，从而促进了肿瘤的发生发展。HECTD1基因表达在胚胎发育过程中起重要作用。且有研究表明，在人类神经管缺陷中，HECTD1基因是一个候选的易感基因。而其表观遗传学方面在国内外的研究中仍是空白。ZNF843是锌指蛋白家族的成员之一。目前被报道的部分锌指蛋白家族成员基因启动子区甲基化水平与肿瘤发生发展密切相关。如肝细胞癌中ZNF331基因启动子区高甲基化高达80％，提示该基因启动子甲基化可作为临床对肝癌早期诊断的候选指标。目前，国内外还没有公开任何关于在结直肠癌中用实时荧光定量PCR检测rRNA pseudogene、HECTD1和ZNF843基因启动子区甲基化程度的检测试剂盒相关研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种用于结直肠癌早期诊断的无创甲基化定量检测试剂盒；其通过实时荧光定量PCR检测受试者血浆或血清样本中游离DNA的rRNA_pseudogene，HECTD1和/或ZNF843基因启动子区甲基化修饰变化，来辅助判断结直肠癌的易感性或发病。在本专利技术的一个实施方案中，所述定量检测试剂盒是通过PCR引物及Taqman探针来完成检测的，其包含检测rRNA_pseudogene基因启动子区甲基化修饰变化的核苷酸序列；所述序列选自以下序列中的任意一组或多组，具体如下：组1：上游引物：5’-GGTTTGGGATTTTAGATTTTTTT-3’下游引物：5’-AAAACCTAAAAACCTCAAATTATTT-3’荧光定量探针：5’-6-FAM-TTTTCGATTCGATTTTTTTGTTTTTG-BHQ1-3’；组2：上游引物：5’-GGAAGGGG(C/T)GGGAAAATTAT-3’下游引物：5’-AATCCCTAAACCCTTCCCT-3’荧光定量探针：5’-6-FAM-TCTACGCTCCCCATAAAATCCGA-BHQ1-3’；组3：上游引物：5’-(C/T)GGGAG(C/T)(C/T)G(C/T)AGGGAAGGGG-3’下游引物：5’-ACCCGACAC(A/G)ACCTAAAACT-3’荧光定量探针：5’-6-FAM-CCTCCGACCCGATCTTTCTACC-BHQ1-3’；在本专利技术的另一个实施方案中，所述定量检测试剂盒还包含检测HECTD1基因启动子区甲基化修饰变化的核苷酸序列；所述序列选自以下序列中的任意一组或多组，具体如下：组4：上游引物：5’-AAAGGAATATGATGAAGGAATGTAT-3’下游引物：5’-AAAAAAAACATACAACTAATAACCCT-3’荧光定量探针：5’-6-FAM-CAACGTAAATCGTTATTTTAAAACGTA-BHQ1-3’；组5：上游引物：5’-AGAATTAAATTTTTATAGTGTTTTTTT-3’下游引物：5’-CAACAACCTAATCAACTTATATACTCT-3’荧光定量探针：5’-6-FAM-AAACACTCTTACGTCCAAACGTACT-BHQ1-3’；组6：上游引物：5’-AAAAAAGGAAAGGTTAAAAGTAAATG-3’下游引物：5’-CCAACTACCCTATCTTATAAAACTAAA-3’荧光定量探针：5’-6-FAM-CATTCGTTCGAATCCGTAACCT-BHQ1-3’；组7：上游引物：5’-TATAAGATAGGGTAGTTGGTTAAAAAA-3’下游引物：5’-(A/G)TAAAACCCAAAACTATCCTCC-3’荧光定量探针：5’-6-FAM-ATCAAAACGCTTACGAAACGCTT-BHQ1-3’；组8：上游引物：5’-GAAGGTTTGGTAG(C/T)GAATTTT-3’下游引物：5’-(A/G)CTAACCCCTTTATTCCCC-3’荧光定量探针：5’-6-FAM本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于结直肠癌早期诊断的无创甲基化定量检测试剂盒；其通过实时荧光定量PCR检测受试者血浆或血清样本中游离DNA的rRNA_pseudogene，HECTD1和/或ZNF843基因启动子区甲基化修饰变化，来辅助判断结直肠癌的易感性或发病。

【技术特征摘要】
1.一种用于结直肠癌早期诊断的无创甲基化定量检测试剂盒；其通过实时荧光定量PCR检测受试者血浆或血清样本中游离DNA的rRNA_pseudogene，HECTD1和/或ZNF843基因启动子区甲基化修饰变化，来辅助判断结直肠癌的易感性或发病。2.根据权利要求1所述的无创甲基化定量检测试剂盒，其特征在于，所述定量检测试剂盒是通过PCR引物及Taqman探针来完成检测的，其包含检测rRNA_pseudogene基因启动子区甲基化修饰变化的核苷酸序列；所述序列选自以下序列中的任意一组或多组，具体如下：组1：上游引物：5’-GGTTTGGGATTTTAGATTTTTTT-3’下游引物：5’-AAAACCTAAAAACCTCAAATTATTT-3’荧光定量探针：5’-6-FAM-TTTTCGATTCGATTTTTTTGTTTTTG-BHQ1-3’；组2：上游引物：5’-GGAAGGGG(C/T)GGGAAAATTAT-3’下游引物：5’-AATCCCTAAACCCTTCCCT-3’荧光定量探针：5’-6-FAM-TCTACGCTCCCCATAAAATCCGA-BHQ1-3’；组3：上游引物：5’-(C/T)GGGAG(C/T)(C/T)G(C/T)AGGGAAGGGG-3’下游引物：5’-ACCCGACAC(A/G)ACCTAAAACT-3’荧光定量探针：5’-6-FAM-CCTCCGACCCGATCTTTCTACC-BHQ1-3’。3.根据权利要求1所述的无创甲基化定量检测试剂盒，其特征在于，所述定量检测试剂盒还包含检测HECTD1基因启动子区甲基化修饰变化的核苷酸序列；所述序列选自以下序列中的任意一组或多组，具体如下：组4：上游引物：5’-AAAGGAATATGATGAAGGAATGTAT-3’下游引物：5’-AAAAAAAACATACAACTAATAACCCT-3’荧光定量探针：5’-6-FAM-CAACGTAAATCGTTATTTTAAAACGTA-BHQ1-3’；组5：上游引物：5’-AGAATTAAATTTTTATAGTGTTTTTTT-3’下游引物：5’-CAACAACCTAATCAACTTATATACTCT-3’荧光定量探针：5’-6-FAM-AAACACTCTTACGTCCAAACGTACT-BHQ1-3’；组6：上游引物：5’-AAAAAAGGAAAGGTTAAAAGTAAATG-3’下游引物：5’-CCAACTACCCTATCTTATAAAACTAAA-3’荧光定量探针：5’-6-FAM-CATTCGTTCGAATCCGTAACCT-BHQ1-3’；组7：上游引物：5’-TATAAGATAGGGTAGTTGGTTAAAAAA-3’下游引物：5’-(A/G)TAAAACCCAAAACTATCCTCC-3’荧光定量探针：5’-6-FAM-ATCAAAACGCTTACGAAACGCTT-BHQ1-3’；组8：上游引物：5’-GAAGGTTTGGTAG(C/T)GAATTTT-3’下游引物：5’-(A/G)CTAACCCCTTTATTCCCC-3’荧光定量探针：5’-6-FAM-CGATTACCCGCGCCAAAA-BHQ1-3’；组9：上游引物：5’-TAGGTTGGAGTGAGGTGGTATTA-3’下游引物：5’-ACAACATAAACCTAATCTCTACAAAAA-3’荧光定量探针：5’-6-FAM-CCAAATACGATAACGCACACCT-BHQ1-3’；组10：上游引物：5’-TTTTTTGTAGAGATTAGGTTTATGTTG-3’下游引物：5’-TCCCAACACTTTATAATTTTACTCTCT-3’荧光定量探针：5’-6-FAM-AACCCGAAATTCGAAACCAA-BHQ1-3’；组11：上游引物：5’-GGTTGTTTGAGGGATTATGTTTT-3’下游引物：5’-ATTCTTTTCAAACTTTATTTCACAC-3’荧光定量探针：5’-6-FAM-AACCC...

【专利技术属性】
技术研发人员：王红卫，段世伟，邓友平，朱勇，王琳，
申请(专利权)人：王红卫，
类型：发明
国别省市：河南;41