乙酰化蛋白质与非乙酰化蛋白质的分离制造技术

本发明专利技术涉及将乙酰化蛋白质与非乙酰化蛋白质分离的方法。具体来说，本发明专利技术涉及使用多模式色谱将乙酰化蛋白质与非乙酰化蛋白质分离的方法。在先前技术中，使用多模式色谱分离抗体。本发明专利技术发现多模式色谱可用于乙酰化蛋白质与非乙酰化蛋白质的所述分离。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术涉及将乙酰化蛋白质与非乙酰化蛋白质分离的方法。具体来说，本专利技术涉及使用多模式色谱将乙酰化蛋白质与非乙酰化蛋白质分离的方法。在先前技术中，使用多模式色谱分离抗体。本专利技术发现多模式色谱可用于乙酰化蛋白质与非乙酰化蛋白质的所述分离。【专利说明】乙酰化蛋白质与非乙酰化蛋白质的分离
本专利技术涉及将乙酰化蛋白质与非乙酰化蛋白质分离的工艺。具体来说，本专利技术涉及使用多模式色谱将乙酰化蛋白质与非乙酰化蛋白质分离的工艺。
技术介绍
蛋白质的修饰将可能分子结构的范围延伸超出由20个编码氨基酸施加的限值，且(如果可逆)产生控制和信号传导的方式。乙酰化作为蛋白质的共转译和转译后修饰发生。至少对于真核蛋白质来说，乙酰化是已报告的200种以上类型中的最常见共价修饰。蛋白质的乙酰化是由多种乙酰基转移酶催化，所述乙酰基转移酶在不同位置处将乙酰基从乙酰基-辅酶A转移到氨基末端残基的α-氨基或赖氨酸残基的ε-氨基。氨基末端乙酰化在乙酰化真核蛋白质的主体上以共转译方式发生，且在原核核糖体蛋白质上和经处理真核调节肽上以转译后方式发生。此外，ε -赖氨酸乙酰化在组蛋白、高迁移率族(HMG)蛋白质、转录因子、核受体和α-微管蛋白上以转译后方式发生。乙酰化影响许多蛋白质功能(包括酶活性、稳定性、DNA结合、蛋白质-蛋白质相互作用和肽-受体识别)，且在多种不同蛋白质上发生。因此，业内标的为纯化乙酰化蛋白质。另一方面，产生重组蛋白的方法已为业内所熟知。报告已显示源自埃希氏大肠杆菌(E.coli)的重组蛋白因转译后修饰给予不同形式的混合物。举例来说，本田进(SusumuHonda)等人报告具有Cys_Tyr_Cys的源自埃希氏大肠杆菌的人类干扰素-Y在N末端处经部分乙酰化且表明rIFN-7的N末端部分是异源的(本田进等人，生物化学与生物物理文献(Archives ofBiochemistry and Biophysics),第 269 卷，第 2 期，3 月，第 612-622 页，1989) ο伊洛蒂.沙尔博(Elodie Charbaut)等人通过基质辅助的激光解吸/离子化飞行时间质谱和nanoES1-Q-TOF串列质谱表征5种在埃希氏大肠杆菌中表达的哺乳动物司他斯敏(stathmin)样亚结构域,且证实异位重组蛋白可在埃希氏大肠杆菌中广泛地NK-乙酰化，且管控NK-乙酰化的规则较复杂且涉及如真核生物中的N末端区域。(伊洛蒂.沙尔博等人FEBS快报(FEBS Letters) 529 (2002) 341-345)。重组蛋白的同型异构体包括二聚体、含N-甲硫氨酸形式(美国专利第5，196，323号)、还原形式、二硫桥同型异构体(美国专利第4，765，903号)和电荷同型异构体(克莱因ML (Klein ML)等人，生物化学与生物物理文献(Arch.Biochem.Biophys.), 276 (2): 531-7,1990)。因此，正确修饰的同型异构体的分离并不简单，这是因为这些组成和构象变体的性质与天然分子的性质极为类似。安德雷亚斯0.黑尔比希(Andreas 0.Helbig)等人报告通过使用基于质谱的专用蛋白质组学技术可以半综合方式阐明N末端处理方法。所报告多蛋白酶方法可鉴别HEK293细胞中的1391乙酰化人类蛋白质N末端且揭示倒数第二个位置对甲硫氨酸氨基肽酶的裂解效率的作用从埃希氏大肠杆菌到人类基本上保守(安德雷亚斯0.黑尔比希等人，分子与细胞蛋白质组学(Molecular&Cellular Proteomics)9: 928-939,2010)。此外，已使用且组合多种不同色谱方法以分离乙酰化蛋白质。最常见蛋白质分离方法是根据待纯化蛋白质与污染物之间的大小、电荷和溶解性差异来预测。基于这些参数的方案包括亲和色谱、离子交换色谱、尺寸排除色谱和疏水性相互作用色谱。爱沃特杨-丝倪克萨(Evert-JanSneekesa)等人揭示，使用毛细管聚苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)单片柱差异性分离乙酰化完整頂9蛋白质同型异构体，且表明乙酰化的数量和于蛋白质上的乙酰化位置二者都对保留具有显著效应(爱沃特杨-丝悅克萨等人，色谱期刊(Journal of Chromatography) A,1194(2008) 199-204)。US6，620，918提供使用离子交换色谱将多肽单体与二聚体和/或其它多聚体分离的工艺。US6，005，075证实纯化干扰素- a -2a的工艺；简单说来，已证实于0.6M胍溶液中再折叠且利用空气氧化后的色谱方案。然而，尚未达成乙酰化蛋白质的分离。因此，业内仍需要研发以高回收率分离乙酰化蛋白质的工艺。【专利附图】【附图说明】图1显不IFN- a -2a的多模式色谱图。图2显示用银染色IFN-a-2a的14% SDS-PAGE。所述分析是基于EP6.0专论-干扰素a -2a浓溶液执行。M:标记；泳道1:罗飞龙(Rofeixm)，I μ g ;泳道2:内部参照IFN- a -2a，0.05 μ g ;泳道 3:内部参照 IFN- a -2a, 0.25 μ g ;泳道 4:内部参照 IFN- a -2a,1.25 μ g ;泳道 5:内部参照 IFN- a -2a, 6.25 μ g ;泳道6:内部参照 IFN- a -2a, 31.25 μ g ;泳道7:IFN- a -2a的纯化主体，5 μ g ;泳道8:1FN_ a -2a的纯化主体，25 μ g。图3显示IFN- a -2b的多模式色谱图。图4显示用银染色IFN- a -2b的14% SDS-PAGE。所述分析是基于EP6.0专论-干扰素ct -2b浓溶液执行。M:标记；泳道1:内部参照IFN- a -2b, 0.05 μ g ;泳道2:内部参照IFN-a -2b, 0.25 μ g ;泳道 3:内部参照 IFN-a-2b，1.25 μ g ;泳道 4:内部参照 IFN-a-2b，6.25 μ g ;泳道5:内部参照IFN- a -2b, 31.25 μ g ;泳道6:IFN- a -2b的纯化主体，5 μ g ;泳道7:IFN- a -2b的纯化主体，25 μ g。图5显示通过RP-HPLC获得的纯度和有关蛋白质。将试样用水稀释到Img / mL且将50 μ g注射到C18柱上。色谱条件是基于EP6.0专论-干扰素α -2浓溶液实施。【具体实施方式】本专利技术成功研发采用多模式色谱将乙酰化蛋白质与非乙酰化蛋白质分离的简单且节省时间的工艺；举例来说，分离所需乙酰化蛋白质或去除微生物重组蛋白产生期间生成的乙酰化变体。本文所提及的所有出版物和专利都以引用方式并入本文中，以达成阐述并揭示(例如)可结合本文所述本专利技术使用的出版物中所述的构筑体和方法的目的。本文所论述公开案仅因为其揭示内容先于本申请案的 申请日期:而提供。绝不能由于揭示内容为先前专利技术或任何其它原因而理解为承认本专利技术无权先于所述揭示内容。除非本文另外定义，否则结合本专利技术使用的科学和技术术语应具有所属领域技术人员通常所了解的含义。所述术语的含义和范畴应明确；然而，本文所提供的定义即使有任何潜在歧义也优先于任何字典或非固有定义。除非上下文另外明确指明，否则本文和在所附权利要求书中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将乙酰化蛋白质与非乙酰化蛋白质分离的方法，其包含将包含乙酰化和非乙酰化蛋白质的不纯制剂施加到多模式色谱载体和利用pH值变化实施洗脱。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：游国明，朱迪·慧泉·周，珍妮弗·勒妮·霍普，
申请(专利权)人：泰福生技股份有限公司，拉荷亚生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：中国台湾;71