Oct4泛素化修饰突变体在提高诱导体细胞重编程效率中的应用制造技术

本发明专利技术涉及Oct4泛素化修饰突变体在提高诱导体细胞重编程效率中的应用。本发明专利技术首次揭示了Wwp2催化Oct4泛素化修饰位点，且该催化作用降低Oct4蛋白质稳定性，而对于Oct4的泛素化位点的选择性突变则可以改变这一状况，可以使得Oct4参与的细胞重编程的效率显著性提高。并且，Ash2l‑b也具有提高诱导重编程效率的功能。

Application of Oct4 ubiquitination modified mutants in improving the efficiency of induced somatic reprogramming

【技术实现步骤摘要】
Oct4泛素化修饰突变体在提高诱导体细胞重编程效率中的应用
本专利技术属于生物
，更具体地，本专利技术涉及Oct4泛素化修饰突变体在提高诱导体细胞重编程效率中的应用。
技术介绍
2006年，日本京都大学ShinyaYamanaka实验室在24种因子中筛选出4个转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc，将这四种因子组合转入小鼠成纤维细胞中诱导其转化为具有发育多能性的细胞，并命名为诱导性多能干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPSCs)。随着该领域研究的深入开展，Oct4在诱导重编程中的核心作用日益凸显。最初确立的重编程四因子中，Klf4和c-Myc能够被Nanog和Lin28或者Esrrb代替。除Oct4以外，Sox2和Klf4都可以被同家族中其他成员代替发挥诱导体细胞重编程的功能。还有研究证明单独Oct4就足够诱导小鼠和人神经干细胞重编程，而小鼠成纤维干细胞也只需导入Oct4一个因子，再结合小分子抑制剂，就可以诱导形成iPSCs。虽然有研究报道核受体Nr5a2(结合Sox2和Klf4)能够代替外源表达Oct4诱导体细胞重编程，而且还有方法不需要任何转入任何外源基因，直接通过小分子化合物就能够实现重编程，但是Oct4在诱导重编程中发挥的关键作用仍然是毋庸置疑。结构生物学研究发现Oct4含有两个由α螺旋连接的POU结构域，α螺旋结构的突变能够抑制重编程，但是不会影响Oct4的其他功能。深入分析发现，α螺旋结构参与介导Oct4蛋白与其他蛋白间的结合，从而招募表观遗传修饰因子到Oct4下游靶基因，激活多能性相关基因的表达，诱导体细胞重编程。由上可见，Oct4的表达水平调控多能性维持、分化与建立等过程，所以研究如何精确调节Oct4的蛋白水平具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供Oct4泛素化修饰突变体在提高诱导体细胞重编程效率中的应用。在本专利技术的第一方面，提供一种细胞重编程的方法，所述的细胞重编程方法中，采用包含Oct4的转录因子组合诱导细胞重编程，其中，所述的Oct4的泛素化位点发生突变，所述的泛素化位点包括：第118位，第121位，第133位，第137位或第144位的赖氨酸。在一个优选例中，所述的氨基酸编号基于SEQIDNO:2所示的野生型Oct4氨基酸序列。在另一优选例中，所述的泛素化位点的突变包括：第118位，第121位，第133位，第137位和第144位的突变；或第121位，第133位，第137位和第144位的突变。在另一优选例中，所述的突变是由赖氨酸突变为不能发生泛素化修饰的氨基酸；较佳地，所述的不能发生泛素化修饰的氨基酸包括：精氨酸。在另一优选例中，所述的包含Oct4的转录因子组合包括：Oct4，Sox2、Klf4和c-Myc组合；或Oct4，Sox2和Klf4。在另一优选例中，所述的细胞是体细胞；较佳地，所述的体细胞包括：成纤维细胞，上皮细胞，血液细胞，神经细胞，胚胎细胞，组织或器官来源的细胞。在另一优选例中，所述的细胞重编程的方法为非治疗性的方法。在另一优选例中，Oct4的泛素化位点的突变提高重编程过程中H3K4甲基化修饰水平，从而促进重编程；或Oct4的泛素化位点的突变减少Oct4的降解，增强Oct4的蛋白稳定性，从而促进重编程。在另一优选例中，所述方法还包括：在细胞内过表达外源性Ash2l-b，使Ash2l-b水平上升。在本专利技术的另一方面，提供一种Oct4突变体，所述的Oct4的泛素化位点发生突变，所述的泛素化位点包括：第118位，第121位，第133位，第137位或第144位的赖氨酸。在一个优选例中，所述的泛素化位点的突变包括：第118位，第121位，第133位，第137位和第144位的突变；或所述的泛素化位点的突变包括：第121位，第133位，第137位和第144位的突变。在另一优选例中，所述的突变是由赖氨酸突变为不能发生泛素化修饰的氨基酸；较佳地，所述的不能发生泛素化修饰的氨基酸包括：精氨酸。在本专利技术的另一方面，提供编码前面任一所述Oct4突变体的多核苷酸。在本专利技术的另一方面，提供一种表达载体，其中包含编码前面任一所述Oct4突变体的多核苷酸。在本专利技术的另一方面，提供一种宿主细胞，其中包含所述的表达载体，或包含编码前面任一所述Oct4突变体的多核苷酸。在一个优选例中，该宿主细胞中还包括：与Oct4共同诱导细胞重编程的转录因子组合；较佳地，转录因子组合包括：Oct4，Sox2、Klf4和c-Myc的组合；或Oct4，Sox2和Klf4的组合。在本专利技术的另一方面，提供前面任一所述的Oct4突变体的用途，用于作为细胞重编程的转录因子。在本专利技术的另一方面，提供Ash2l-b的用途，用于促进细胞重编程。在本专利技术的另一方面，提供一种用于进行细胞重编程的试剂盒，所述的试剂盒中包括：前面任一所述的Oct4突变体，或能表达该Oct4突变体的表达构建物(如表达载体)。在一个优选例中，所述的试剂盒中还包括转录因子：Sox2、Klf4、c-Myc组合，Sox2与Klf4的组合，或能表达该Sox2、Klf4和/或c-Myc的表达构建物(如表达载体)；或所述的试剂盒中还包括：Ash2l-b或能重组表达Ash2l-b的表达构建物(如表达载体)。在本专利技术的另一方面，提供一种筛选促进细胞重编程的潜在物质的方法，所述方法包括：(1)将候选物质与Wwp2与Oct4相互作用的体系接触；(2)检测候选物质对Wwp2与Oct4相互作用的影响；若所述候选物质可抑制Wwp2与Oct4相互作用，则表明该候选物质是促进细胞重编程的潜在物质。在一个优选例中，在测试组中，将候选物质加入到Wwp2与Oct4相互作用的体系中；和/或步骤(2)包括：检测测试组的体系中Wwp2与Oct4相互作用情况，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的Wwp2与Oct4相互作用的体系；如果测试组中Wwp2与Oct4相互作用在统计学上弱于对照组，就表明该候选物质是促进细胞重编程的潜在物质。在另一优选例中，所述的相互作用为：Wwp2催化Oct4发生泛素化修饰(即：所述的抑制相互作用或相互作用弱于，表示Wwp2催化Oct4发生泛素化修饰被抑制或减弱)。在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1、Wwp2催化Oct4泛素化修饰突变体的构建。(A)Oct4泛素化修饰位点鉴定示意图。(B)质谱鉴定发现的五个赖氨酸位点可能是泛素化修饰位点。(C)体外泛素化修饰实验验证五个赖氨酸位点是Oct4泛素化修饰的主要位点。(D)Wwp2催化Oct4泛素化修饰的五个位点在多个哺乳物种(从上到下依次为人、猩猩、猴子、狼、牛、小鼠、大鼠)中序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞重编程的方法，其特征在于，所述的细胞重编程方法中，采用包含Oct4的转录因子组合诱导细胞重编程，其中，所述的Oct4的泛素化位点发生突变，所述的泛素化位点包括：第118位，第121位，第133位，第137位或第144位的赖氨酸。/n

【技术特征摘要】
1.一种细胞重编程的方法，其特征在于，所述的细胞重编程方法中，采用包含Oct4的转录因子组合诱导细胞重编程，其中，所述的Oct4的泛素化位点发生突变，所述的泛素化位点包括：第118位，第121位，第133位，第137位或第144位的赖氨酸。


2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的泛素化位点的突变包括：第118位，第121位，第133位，第137位和第144位的突变；或第121位，第133位，第137位和第144位的突变。


3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的突变是由赖氨酸突变为不能发生泛素化修饰的氨基酸；较佳地，所述的不能发生泛素化修饰的氨基酸包括：精氨酸。


4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的包含Oct4的转录因子组合包括：Oct4，Sox2、Klf4和c-Myc组合；或Oct4，Sox2和Klf4。


5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞是体细胞；较佳地，所述的体细胞包括：成纤维细胞，上皮细胞，血液细胞，神经细胞，胚胎细胞，组织或器官来源的细胞。


6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，Oct4的泛素化位点的突变提高重编程过程中H3K4甲基化修饰水平，从而促进重编程；或Oct4的泛素化位点的突变减少Oct4的降解，增强Oct4的蛋白稳定性，从而促进重编程。


7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：在细胞内过表达外源性Ash2l-b，使Ash2l-b水平上升。


8.一种Oct4突变体，其特征在于，所述的Oct4的泛素化位点发生突变，所述的泛素化位点包括：第118位，第121位，第133位，第137位或第144位的赖氨酸。


9.如权利要求8所述的Oct4突变体，其特征在于，所述的泛素化位点的突变包括：第118位，第121位，第133位，第137位和第144位的突变；或所述的泛素化位点的突变包括：第121位，第133位，第137位和第144位的突变。


10.如权利要求8或9所述的Oct4突变体，其特征在于，所述的突变是由赖氨酸突变为不能...

【专利技术属性】
技术研发人员：金颖，廖兵，李爽，肖峰，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，上海交通大学医学院，
类型：发明
国别省市：上海;31