酶催化特异性改变的广藿香醇合酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及酶催化特异性改变的广藿香醇合酶突变体及其应用。本发明专利技术揭示了突变型广藿香醇合酶，其催化特异性发生变化，从而可根据需要调控其催化产物的产量，特别是提高主产物广藿香醇的产量。

【技术实现步骤摘要】
酶催化特异性改变的广藿香醇合酶突变体及其应用
本专利技术属于生物
；更具体地，本专利技术涉及一种酶催化特异性改变的广藿香醇合酶突变体及其应用。
技术介绍
植物挥发油(精油)是具有一定挥发性的油状液体的统称，是植物芳香物质的提取物。含挥发油的中草药非常多，亦多具芳香气味，尤以唇形科(薄荷、紫苏、藿香等)、伞形科(茴香、当归、芫荽、白芷、川芎等)、菊科(艾叶、茵陈篙、苍术、白术、木香等)、芸香科(橙、桔、花椒等)、樟科(樟、肉桂等)、姜科(生姜、姜黄、郁金等)等科更为丰富。植物挥发油成分复杂，主要由萜类化合物构成，芳香族化合物次之，还包含少量的脂肪酸衍生物。其中萜类化合物又分为单萜、倍半萜以及少量的二萜，常见的如薄荷中的薄荷酮、广藿香中的广藿香醇等。挥发油大多具有抑菌杀毒、凝神静气、解热镇痛、矫味定香等作用，在医药、食品、日化用品等方面应用广泛。目前植物挥发油的研究主要集中在提取工艺优化、化学成分分析以及精油成分的生物活性研究等方面，挥发油合成途径的酶工程改造方面的研究很少。广藿香(Pogostemoncablin)是唇形科多年生草本植物，所产生的广藿香精油被广泛应用于香料及医疗行业。与其它唇形科植物产生的混合型精油不同，广藿香精油主要是由倍半萜构成(Deguerry，F.等(2006).Archivesofbiochemistryandbiophysics454，123-136)。广藿香精油包含约24种倍半萜(Buré，C.M.等(2004).JournalofEssentialOilResearch16，17-19)，其中广藿香醇((-)-patchoulol)约占34.8％，是其重要组分。广藿香醇香味持久、独特宜人是良好的定香剂，目前作为天然香料被广泛用于日化产品中。它也是传统中药藿香正气水的主要药效成分。此外，广藿香醇还具有抑制真菌繁殖，驱除和毒杀白蚁的作用(杜一民等(1998)，广藿香的化学成分及其药理作用研究进展；中药新药与临床药理9，238-240)。广藿香精油的生物合成主要由在广藿香中发现的广藿香醇合酶(patchoulolsynthase，PTS)完成，它是一个多产物酶合成了广藿香叶片提取物中广藿香醇以及其它13种倍半萜产物，在大肠杆菌异源表达的蛋白能够产生36.9％相对含量的广藿香醇(Deguerry，F.等)。此外，在广藿香中还存在与PTS有3.4％蛋白序列差异的广藿香醇合酶异构体(PTSiso)，大肠杆菌重组表达的蛋白催化产物与PTS有很大的差异，其中广藿香醇相对含量只有27.2％。因此，如何有效地提高广藿香醇的重组表达产量或活性，是本领域需要深入研究的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种酶催化特异性改变的广藿香醇合酶突变体及其应用。在本专利技术的第一方面，提供广藿香醇合酶突变体，所述突变体相对于野生型的广藿香醇合酶，所述突变体的氨基酸序列对应于SEQIDNO:2，第445位突变为丝氨酸、半胱氨酸或甘氨酸。在一个优选例中，所述的广藿香醇合酶突变体是：(a)氨基酸序列如SEQIDNO:2但第445位突变为丝氨酸、半胱氨酸或甘氨酸所示的蛋白；(b)由(a)所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个(如1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个；更佳地1-3个)氨基酸且保留(a)蛋白活性的由(a)衍生的蛋白；且该蛋白的氨基酸序列中对应于SEQIDNO:3第445位位置的氨基酸为丝氨酸；(c)与(a)所示的氨基酸序列具有80％以上(较佳地85％以上，更佳地90％以上，进一步更佳地95％以上，如98％以上、99％以上)序列相同性的保留(a)蛋白活性的由(a)衍生的蛋白；且该蛋白的氨基酸序列中对应于SEQIDNO:3第445位位置的氨基酸为丝氨酸；或(d)(a)～(c)的蛋白的生物活性片段，其保留(a)蛋白活性。在本专利技术的另一方面，提供分离的多核苷酸，所述的核酸是编码所述的广藿香醇合在本专利技术的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。在本专利技术的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。在本专利技术的另一方面，提供一种生产所述的广藿香醇合酶突变体的方法，包括步骤：(1)培养所述的宿主细胞，获得培养物；和(2)从培养物中分离所述的广藿香醇合酶突变体。在本专利技术的另一方面，提供一种调节广藿香醇合酶的催化活性或选择性的方法，所述方法包括：将广藿香醇合酶的第445位突变为丝氨酸、半胱氨酸或甘氨酸。在一个优选例中，将广藿香醇合酶的第445位突变为丝氨酸，从而促进其催化产生α-广藿香醇；或抑制其产生石竹烯、α-愈创木烯、塞瑟尔烯、α-广藿香烯、α-布藜烯。在另一优选例中，将广藿香醇合酶的第445位突变为半胱氨酸，从而促进其催化产生β-广藿香烯、β-榄香烯、大根香叶烯A、石竹烯、α-人参烯、榄香醇、蓝桉醇；或抑制其产生α-愈创木烯、塞瑟尔烯、α-广藿香烯、α-布藜烯、α-广藿香醇。在另一优选例中，将广藿香醇合酶的第445位突变为甘氨酸，从而促进其催化产生法尼醇、榄香醇、蓝桉醇；或抑制其产生β-广藿香烯、石竹烯、α-愈创木烯、塞瑟尔烯、α-广藿香烯、γ-广藿香烯、4,11-愈创木二烯、α-人参烯、α-广藿香醇。在本专利技术的另一方面，提供所述的广藿香醇合酶突变体的用途，用于作为催化剂，催化产生α-广藿香醇；其中，该突变体的氨基酸序列对应于SEQIDNO:2，第445位突变为丝氨酸。在本专利技术的另一方面，提供一种催化产生α-广藿香醇的方法，所述方法包括：以所述的广藿香醇合酶突变体为催化剂进行反应，催化法尼基焦磷酸(farnesylpyrophosphate，FPP)环化，获得包含α-广藿香醇的产物；其中，该突变体的氨基酸序列对应于SEQIDNO:2，第445位突变为丝氨酸。在一个优选例中，广藿香醇合酶突变体催化FPP环化在细胞内或细胞外进行。在另一优选例中，所述的广藿香醇合酶突变体催化法尼基焦磷酸环化在细胞内进行，包括步骤：将所述的广藿香醇合酶突变体的编码基因转化入宿主细胞，培养该细胞，从而获得包含α-广藿香醇的产物。在另一优选例中，所述的广藿香醇合酶突变体催化法尼基焦磷酸环化在细胞内进行，包括步骤：将所述的广藿香醇合酶突变体的编码基因以及法尼基焦磷酸产生酶的编码基因转化宿主细胞，培养该细胞，从而获得包含α-广藿香醇的产物。在另一优选例中，所述的法尼基焦磷酸产生酶为MVA/MEP途径中的酶；选自但不限于：乙酰辅酶A硫解酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶、IPP异构酶、5-磷酸-D-1-脱氧木酮糖合成酶5-磷酸-D-1-脱氧木酮糖还原异构酶、异戊烯二磷酸异构酶、5-磷酸-D-1-脱氧木酮糖合成酶、5-磷酸-D-1-脱氧木酮糖还原异构酶、4-磷酸-2C-甲基赤藓醇4-胞苷磷酸合酶、2C-甲基赤藓醇4-胞苷磷酸激酶、2C-甲基赤藓醇-2，4-焦磷酸合酶、1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.广藿香醇合酶突变体，其特征在于，所述突变体相对于野生型的广藿香醇合酶，所述突变体的氨基酸序列对应于SEQ ID NO:2，第445位突变为丝氨酸、半胱氨酸或甘氨酸。/n

【技术特征摘要】
1.广藿香醇合酶突变体，其特征在于，所述突变体相对于野生型的广藿香醇合酶，所述突变体的氨基酸序列对应于SEQIDNO:2，第445位突变为丝氨酸、半胱氨酸或甘氨酸。


2.如权利要求1所述的广藿香醇合酶突变体，其特征在于，其是：
(a)氨基酸序列如SEQIDNO:2但第445位突变为丝氨酸、半胱氨酸或甘氨酸所示的蛋白；
(b)由(a)所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留(a)蛋白活性的由(a)衍生的蛋白；且该蛋白的氨基酸序列中对应于SEQIDNO:3第445位位置的氨基酸为丝氨酸；
(c)与(a)所示的氨基酸序列具有80％以上序列相同性的保留(a)蛋白活性的由(a)衍生的蛋白；且该蛋白的氨基酸序列中对应于SEQIDNO:3第445位位置的氨基酸为丝氨酸；或
(d)(a)～(c)的蛋白的生物活性片段，其保留(a)蛋白活性。


3.分离的多核苷酸，其特征在于，所述的核酸是编码权利要求1或2所述的广藿香醇合酶突变体。


4.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。


5.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求4所述的载体，或基因组中整合有权利要求3所述的多核苷酸。


6.一种生产权利要求1或2所述的广藿香醇合酶突变体的方法，其特征在于，包括步骤：
(1)培养权利要求5所述的宿主细胞，获得培养物；和
(2)从培养物中分离权利要求1或2所述的广藿香醇合酶突变体。


7.一种调节广藿香醇合酶的催化活性或选择性的方法，其特征在于，所述方法包括：将广藿香醇合酶的第445位突变为丝氨酸、半胱氨酸或甘氨酸。


8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，将广藿香醇合酶的第445位突变为丝氨酸，从而促进其催化产生α-广藿香醇；或抑制其产生石竹烯、α-愈创木烯、塞瑟尔烯、α-广藿香烯、α-布藜烯。


9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，将广藿香醇合酶的第445位突变为半胱氨酸，从而促进其催化产生β-广藿香烯、β-榄香烯、大根香叶烯A、石竹烯、α-人参烯、榄香醇、蓝桉醇；或抑制其产生α-愈创木烯、塞瑟尔...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈晓亚，方欣，杨蕾，李辰意，王凌健，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31