ECM1基因敲除小鼠在抗肝纤维化药物筛选中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种ECM1基因敲除小鼠在抗肝纤维化药物筛选中的应用，具体地，本发明专利技术提供了一种非人哺乳动物的肝纤维化或其相关疾病动物模型的制备方法，包括以下步骤：(a)提供非人哺乳动物的细胞，将所述细胞中的ECM1基因失活，得到ECM1基因失活的非人哺乳动物细胞；和(b)利用步骤(a)中得到的ECM1基因失活的细胞，制备得到ECM1基因失活的肝纤维化或其相关疾病动物模型。本发明专利技术的动物模型是一种有效的肝纤维化或其相关疾病的动物模型，可用于研究肝纤维化或其相关疾病，并可以用于特定药物的筛选和测试试验。

Application of ECM1 gene knockout mice in the screening of anti fibrosis drugs

【技术实现步骤摘要】
ECM1基因敲除小鼠在抗肝纤维化药物筛选中的应用
本专利技术涉及生物医药领域，具体地，本专利技术涉及ECM1基因敲除小鼠在抗肝纤维化药物筛选中的应用。
技术介绍
肝纤维化是一个动态的肝脏受损修复过程，类似于伤口修复反应，其特征是细胞外基质在肝脏内的非正常聚集。任何一种导致肝脏长期慢性损伤的因素都会诱导出这种修复反应。在中国，最常见的的肝脏损伤因素就是HBV和HCV慢性感染导致的肝损伤。而在发达国家非酒精性脂肪性肝(NAFLD)则是最常见的发病因素。随着经济水平的发展和优秀的抗病毒药物和疫苗的出现，HBV和HCV的发病率在逐渐下降，非酒精性脂肪性肝的发病率和流行率都在上升。NAFLD现在被公认为是美国慢性肝病的最常见原因，相信随着中国经济的不断发展，非酒精性脂肪性肝也会成为中国的头号肝病。其他肝纤维化病因也包括酒精性肝病，药物引起的肝脏疾病，和自身免疫，代谢和胆道疾病引起的肝脏疾病。肝纤维化的过程是肝脏内胶原纤维生成的速度大于降解的速度。尽管肝纤维化可以在消除损伤后发生逆转，但慢性持续损伤可导致细胞外基质蛋白高度交联并丧失潜在的可逆性。肝硬化则是纤维化的最终阶段，肝实质大量缺失和血管结构发生严重扭曲。肝硬化可导致肝功能失调性疾病，这是一个重要的致死性疾病之一。失代偿性肝硬化的表现包括可以导致腹水的门静脉高压，静脉曲张出血和肝性脑病。此外，肝硬化是一种“癌前状态”，伴随着时间的推移，肝细胞癌(HCC)的风险增加，即使是尚未出现肝硬化的进展性纤维化患者，其HCC的风险也会增加。目前肝纤维化或其相关疾病动物模型多为诱导型动物模型，有很多缺点，比如造模时间过长，无肝硬化症状如腹水或死亡等。因此本领域迫切需要开发一种可以作为研究肝纤维化的发生机理以及新药筛选的有力工具的动物模型。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可以作为研究肝纤维化的发生机理以及新药筛选的有力工具的动物模型。本专利技术第一方面提供了一种非人哺乳动物的肝纤维化或其相关疾病动物模型的制备方法，包括以下步骤：(a)提供非人哺乳动物的细胞，将所述细胞中的ECM1基因失活，得到ECM1基因失活的非人哺乳动物细胞；和(b)利用步骤(a)中得到的ECM1基因失活的细胞，制备得到ECM1基因失活的肝纤维化或其相关疾病动物模型。在另一优选例中，所述肝纤维化或其相关疾病动物模型为非诱导型自发肝纤维化或其相关疾病的动物模型。在另一优选例中，在步骤(a)中，包括如下步骤：(a1)利用DNA同源重组技术，将所述ECM1基因中的编码区(如外显子1至外显子10)或非编码区(如5’UTR或3’UTR)或3’编码区或内含子区进行剔除或基因编辑，并用筛选标记替换，得到ECM1基因失活的非人哺乳动物细胞。在另一优选例中，在步骤(b)中，还包括如下步骤：(b1)利用步骤(a)中得到的ECM1基因失活的非人哺乳动物细胞制备得到嵌合非人哺乳动物；(b2)将步骤(b1)中得到的嵌合非人哺乳动物和正常野生型非人哺乳动物交配繁育，在后代中筛选获得ECM1基因失活的杂合子非人哺乳动物；和(b3)通过将步骤(b2)中得到的杂合子非人哺乳动物相互交配获得ECM1基因失活的纯合子非人哺乳动物，从而得到ECM1基因失活的非人哺乳动物的动物模型。在另一优选例中，在步骤(b3)中，还包括步骤(b4)：将ECM1基因失活的纯合子非人哺乳动物与同一物种的肝脏特异性的特异性敲除工具非人哺乳动物或同一物种的全身敲除工具的非人哺乳动物进行杂交，从而获得肝脏特异性的ECM1基因失活或全身性的ECM1基因失活的非人哺乳动物的动物模型。在另一优选例中，所述将ECM1基因失活包括基因剔除、基因中断或基因插入。在另一优选例中，所述基因失活包括ECM1基因不表达，或表达没有活性的ECM1蛋白。在另一优选例中，所述将ECM1基因失活还包括将ECM1基因或其蛋白的表达下降50％，较佳地，70％，更佳地，80％，更佳地，90％，更佳地，100％。在另一优选例中，所述的ECM1基因失活是肝脏特异性或全身性的ECM1基因失活。在另一优选例中，所述非人哺乳动物为啮齿动物或灵长目动物，较佳地包括小鼠、大鼠、兔和/或猴。在另一优选例中，所述非人哺乳动物是小鼠，并且在步骤(b4)中把ECM1Loxp/Loxp小鼠与工具鼠NSE(neuron-specificenolase)-Cre交配，即得到在肝脏特异性ECM1基因敲除小鼠简称Alb-cre/ECM1flox/flox小鼠(即肝脏特异性ECM1失活小鼠)。在另一优选例中，所述非人哺乳动物是小鼠，并且在步骤(b4)中把ECM1基因敲除杂合子小鼠与ECM1基因敲除杂合子小鼠交配，即得到全身性ECM1基因敲除小鼠，简称ECM1-KO小鼠(即全身性ECM1失活小鼠)。在另一优选例中，所述筛选标记选自下组：抗性基因、荧光蛋白基因、或其组合。在另一优选例中，所述筛选标记包括neo基因和/或GFP基因。在另一优选例中，所述步骤(b)中得到的ECM1基因失活的非人哺乳动物的动物模型中，与野生型对照动物相比，具有选自下组的一个或多个特征：(t1)肝纤维化进展程度增加；(t2)α-SMA阳性细胞的数量增加；(t3)羟脯氨酸的含量增加；(t4)肝纤维化的相关基因表达量增加；(t5)谷草转氨酶(AST)和/或谷丙转氨酶(ALT)的含量略微增加；(t6)星状细胞HSC的激活程度增加；(t7)胶原蛋白含量增加。在另一优选例中，所述肝纤维化的相关基因表达量增加指相对于野生型对照动物，肝纤维化的相关基因表达量≥500，较佳地，≥800，更佳地，≥1000。在另一优选例中，所述肝纤维化的相关基因选自下组：a-SMA、Col1a1、Col1a3、Desmin、或其组合。本专利技术第二方面提供了一种本专利技术第一方面所述的方法制备的非人哺乳动物模型的用途，该模型用作研究肝纤维化或其相关疾病的动物模型。在另一优选例中，所述肝纤维化或其相关疾病选自下组：肝纤维化、肝硬化、酒精肝、脂肪肝、自身免疫性肝病、药物性肝损伤、病毒性肝炎、或其组合。本专利技术第三方面提供了一种本专利技术第一方面所述的方法制备的非人哺乳动物模型的用途，用于筛选或鉴定可减轻或治疗肝纤维化或其相关疾病的物质(治疗剂)。本专利技术第四方面提供了一种筛选或确定预防和/或治疗肝纤维化或其相关疾病的潜在治疗剂的方法，包括步骤：(a)在测试组中，在培养体系中，在测试化合物的存在下，培养表达ECM1的细胞一段时间T1，检测测试组所述培养体系中的ECM1基因或其蛋白的表达水平E1；和/或ECM1蛋白的活性水平V1；并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述培养体系中的ECM1基因或其蛋白的表达水平E2；和/或ECM1蛋白的活性水平V2；和(b)将上一步骤所检测的E1、E2，和/或V1、V2进行比较，从本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非人哺乳动物的肝纤维化或其相关疾病动物模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n(a)提供非人哺乳动物的细胞，将所述细胞中的ECM1基因失活，得到ECM1基因失活的非人哺乳动物细胞；和/n(b)利用步骤(a)中得到的ECM1基因失活的细胞，制备得到ECM1基因失活的肝纤维化或其相关疾病动物模型。/n

【技术特征摘要】
1.一种非人哺乳动物的肝纤维化或其相关疾病动物模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)提供非人哺乳动物的细胞，将所述细胞中的ECM1基因失活，得到ECM1基因失活的非人哺乳动物细胞；和
(b)利用步骤(a)中得到的ECM1基因失活的细胞，制备得到ECM1基因失活的肝纤维化或其相关疾病动物模型。


2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述肝纤维化或其相关疾病动物模型为非诱导型自发肝纤维化或其相关疾病的动物模型。


3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的ECM1基因失活是肝脏特异性或全身性的ECM1基因失活。


4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)中得到的ECM1基因失活的非人哺乳动物的动物模型中，与野生型对照动物相比，具有选自下组的一个或多个特征：
(t1)肝纤维化进展程度增加；
(t2)α-SMA阳性细胞的数量增加；
(t3)羟脯氨酸的含量增加；
(t4)肝纤维化的相关基因表达量增加；
(t5)谷草转氨酶(AST)和/或谷丙转氨酶(ALT)的含量略微增加；
(t6)星状细胞HSC的激活程度增加；
(t7)胶原蛋白含量增加。


5.一种权利要求1所述的方法制备的非人哺乳动物模型的用途，其特征在于，该模型用作研究肝纤维化或其相关疾病的动物模型。


6.一种权利要求1所述的方法制备的非人哺乳动物模型的用途，其特征在于，用于筛选或鉴定可减轻或治疗肝纤维化或其相关疾病的物质(治疗剂)。


7.一种筛选或确定预防和/或治疗肝纤维化或其相关疾病的潜在治疗剂的方法，其特征在于，包括步骤：
(a)在测试组中，在培养体...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙兵，范卫国，张亚光，凌志洋，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31