【技术实现步骤摘要】
本申请属于异种移植领域，具体涉及猪细胞表达并分泌抗人cd40单链抗体的方法及在降低异种免疫排斥中的应用。
技术介绍
1、器官移植是器官衰竭患者终末治疗的重要手段，对于延续患者生命有着重要的意义，但当前器官短缺这一现状已成为制约器官移植领域发展的巨大障碍，致使许多发展为等待器官移植的患者无法获得器官，在等待器官期间死亡。
2、猪是一种应用较为广泛的实验动物，其器官结构，大小及生理情况与人相近，与非人灵长类动物相比具有人畜共患病风险小、繁育周期短、饲养成本低及更低的伦理问题，且猪的体细胞核移植技术与基因编辑技术更为成熟，因此众多的科学家希望将猪作为异种器官供体来源从而解决器官短缺的问题。
3、然而由于物种之间的差异性，猪器官移植到人体后会发生十分严重的排斥反应。按照排斥反应发展的时间顺序，异种排斥反应可分为超急性排斥、急性体液排斥反应、炎症反应、适应性免疫反应等。人体血液中含有抗α-半乳糖（α-gal）抗原的天然预存抗体，含量占人体免疫球蛋白总量的1~4%，而α-gal抗原存在于除了人和旧大陆灵长类动物的绝大多数哺乳动物中，作为蛋白表面的一种糖基化修饰，由α-1, 3-半乳糖基转移酶（α-1,3galactosyltransferase, ggta1）基因编码产生的糖基转移酶产生，一旦将猪的器官移植至人体后，预先形成的针对α-gal抗体与异种移植物结合，激活补体级联反应，并在移植后几min内导致血管内皮细胞活化，细胞裂解和广泛的血管内血栓形成，使得异种器官迅速衰竭，这种反应被称为超急性排斥反应（har）。p>
4、即便通过敲除猪细胞内的ggta1基因，人体血液中还存在部分针对猪细胞表面non-gal抗原的抗体，这些抗体会导致猪器官在几天或几周内发生类似的体液排斥反应，称为急性体液性异种排斥反应（ahxr），目前已确定两种non-gal抗原，分别为2-n-羟乙酰神经氨酸（neu5gc）及sda，合成该两种糖抗原相关的基因分别为cmah及β4galnt2，因此通过敲除ggta1、cmah及β4galnt2（tko），同时敲入人的补体调节蛋白衰变加速因子（cd55），和膜辅蛋白（cd46）能够很好地减缓人体血液中天然预存抗体对异种器官的攻击，延长器官的存活时间。
5、除了har以及ahxr反应，由于人与猪之间的物种差异性，如猪的血栓调节蛋白（thbd）与人的凝血酶虽然能够结合，但是二者结合产生的复合物无法很好地激活人的蛋白c，由此打破人体血液的凝血平衡，造成凝血反应，从而在器官内部形成血栓，造成血栓性微血管病以及消耗性凝血反应，因此可以通过在猪基因组的安全港位点敲入人的thbd和蛋白c受体（epcr），降低凝血反应。异种器官在人体内的长期存活还需面对的一个重大障碍是机体的适应性免疫，相较于细胞免疫，体液免疫所导致的排斥作用在猪到非人灵长类动物的移植过程中被更多的记录下来，其中猪的白细胞抗原（sla）在介导异种移植过程中的适应性免疫发挥了重要作用，因此可通过降低或者敲除sla来抑制这一反应的进行；
6、但是现有的基因修饰策略只能降低异种免疫排斥，但是由于物种之间的差异性，在猪器官移植到人类后，依然会作为异源物质，被人类免疫系统识别，并产生攻击猪器官的抗体。研究表明cd40-cd40l二者相互作用可参与t细胞活化、b细胞增殖分化及抗体的转换等过程，在异种免疫识别和攻击中起到重要作用。
7、目前的猪器官移植到人类或非人灵长类的实验中，对猪进行多基因修饰可以降低猪供体器官的免疫原性，表达的免疫相容性蛋白可以降低补体杀伤、nk细胞杀伤、巨噬细胞吞噬和t细胞杀伤。但是依然无法阻止宿主免疫系统对猪器官的识别和产生免疫攻击。
8、在进行猪器官到人类或非人灵长类的器官移植时，同时在给予受体大剂量免疫抑制药物的治疗，使之更好在人体环境中存活并发挥功能，延长受者寿命。常用的免疫抑制方案包括，在移植手术之前耗竭宿主外周t淋巴细胞与b淋巴细胞以及进行补体抑制，如抗胸腺细胞球蛋白（atg）、利妥昔单克隆抗体（rituximab）、补体c1酯酶抑制剂（berinert）和眼镜蛇毒因子（cobra venom factor），以及还未被fda所批准的阻断cd40- cd40l免疫共刺激信号的单克隆抗体药物。长期施用且共刺激阻断药物多为单克隆抗体，其带来经济成本过高、使用剂量、潜在的不良反应仍是需要进一步研究改进的问题。
技术实现思路
1、基于此，本申请一实施例提供信号肽在猪血管内皮细胞中表达anti-cd40 scfv中的应用。
2、本申请一方面提供分泌信号肽在表达anti-cd40 scfv中的应用，其特征在于，所述信号肽的氨基酸序列如seq id no.1~seq id no.3所示。
3、在其中一个实施例中，所述表达anti-cd40 scfv为猪细胞内源性表达和分泌anti-cd40 scfv。
4、在其中一个实施例中，所述anti-cd40 scfv的氨基酸序列如seq id no.4所示。
5、在其中一个实施例中，所述anti-cd40 scfv的c端连接有标签蛋白。
6、在其中一个实施例中，所述标签蛋白包括his标签蛋白、ha标签蛋白、c-myc标签蛋白、avitag标签蛋白、snap标签蛋白和flag标签蛋白中的一种或多种。
7、本申请另一方面提供一种在猪细胞内表达并分泌anti-cd40 scfv的方法，其特征在于，包括以下步骤：
8、制备含有seq id no.1~seq id no.3所示信号肽和如seq id no.4所示anti-cd40scfv的表达载体，以及；
9、将所述表达载体导入猪细胞。
10、在其中一个实施例中，所述表达载体包括慢病毒表达载体、pb转座载体中的一种或多种。
11、在其中一个实施例中，所述载体的c端还包括puromycin。
12、在其中一个实施例中，所述猪细胞为猪内皮细胞。
13、本申请另一方面还提供一种一种降低异种移植免疫排斥的方法，其特征在于，该方法包括：
14、在猪细胞内表达并分泌anti-cd40 scfv，阻断cd40-cd40l共刺激通路。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.分泌信号肽在表达anti-CD40 scFv中的应用，其特征在于，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的分泌信号肽在表达anti-CD40 scFv中的应用，其特征在于，所述表达anti-CD40 scFv为猪细胞内源性表达和分泌anti-CD40 scFv。
3.根据权利要求1所述的分泌信号肽在表达anti-CD40 scFv中的应用，其特征在于，所述anti-CD40 scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求1所述的分泌信号肽在表达anti-CD40 scFv中的应用，其特征在于，所述anti-CD40 scFv的C端连接有标签蛋白。
5.根据权利要求1所述的分泌信号肽在表达anti-CD40 scFv中的应用，其特征在于，所述标签蛋白包括His标签蛋白、HA标签蛋白、c-Myc标签蛋白、AviTag标签蛋白、SNAP标签蛋白和Flag标签蛋白中的一种或多种。
6.一种在猪细胞内表达并分泌anti-CD40 scFv的方法
7.根据权利要求6所述的在猪细胞内表达并分泌anti-CD40 scFv的方法，其特征在于，所述表达载体包括慢病毒表达载体、PB转座载体中的一种或多种。
8.根据权利要求6所述的在猪细胞内表达并分泌anti-CD40 scFv的方法，其特征在于，所述载体的C端还包括Puromycin。
9.根据权利要求6~8任一项所述的在猪细胞内表达并分泌anti-CD40 scFv的方法，其特征在于，所述猪细胞为猪内皮细胞。
10.一种降低异种移植免疫排斥的方法，其特征在于，该方法包括：
...【技术特征摘要】
1.分泌信号肽在表达anti-cd40 scfv中的应用，其特征在于，所述信号肽的氨基酸序列如seq id no.1~seq id no.3所示。
2.根据权利要求1所述的分泌信号肽在表达anti-cd40 scfv中的应用，其特征在于，所述表达anti-cd40 scfv为猪细胞内源性表达和分泌anti-cd40 scfv。
3.根据权利要求1所述的分泌信号肽在表达anti-cd40 scfv中的应用，其特征在于，所述anti-cd40 scfv的氨基酸序列如seq id no.4所示。
4.根据权利要求1所述的分泌信号肽在表达anti-cd40 scfv中的应用，其特征在于，所述anti-cd40 scfv的c端连接有标签蛋白。
5.根据权利要求1所述的分泌信号肽在表达anti-cd40 scfv中的应用，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：赖良学，吴涵，夏聪，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。