一种核糖体失活蛋白基因病毒载体构建及其在肿瘤细胞中表达活性蛋白的方法技术

本专利申请属于生物工程技术领域，具体公开了一种核糖体失活蛋白基因病毒载体构建及其在肿瘤细胞中表达活性蛋白的方法，包括如下步骤：步骤一、选取合适的核糖体失活蛋白，对其成熟区基因进行人源化表达的密码子优化；步骤二、野生型及优化后基因的腺病毒载体构建与重组病毒包装；步骤三、重组腺病毒感染肿瘤细胞，并检测使其在肿瘤细胞中蛋白表达及其抗肿瘤效应。本方案将α‑苦瓜素基因进行密码子优化，构建能感染哺乳动物肿瘤细胞的腺病毒表达载体系统，以适合于在肿瘤细胞中表达活性蛋白，克服了现有技术中使用原核细胞表达体系只能在大肠杆菌中表达以及使用植物病毒载体只能在植物细胞中表达而不能在肿瘤细胞中表达和杀伤肿瘤的缺陷。

Construction of a ribosome inactivating protein gene virus vector and its expression in tumor cells

【技术实现步骤摘要】
一种核糖体失活蛋白基因病毒载体构建及其在肿瘤细胞中表达活性蛋白的方法
：本专利技术申请属于生物工程
，更具体的说是涉及一种核糖体失活蛋白基因病毒载体构建及其在肿瘤细胞中表达活性蛋白的方法。
技术介绍
：核糖体失活蛋白(RibosomeInactivatingProteins，RIPs)是一类主要分布于植物体内的毒蛋白，具有RNAN-糖苷酶活性。RIPs在活性位点区域内具有高度保守的活性裂隙残基和二级结构，能作用于真核细胞大亚基28S导致核糖体失活，抑制蛋白质的生物合成，从而对细胞产生细胞毒作用。RIPs分为三种类型，I型RIP是单肽链蛋白，分子量大约1l～30可kDa，如苦瓜核糖体失活蛋白、天花粉蛋白(TCS)、美洲商陆蛋白(PAP)、丝瓜毒蛋白(1uffin)、肥皂草素等，大多数核糖体失活蛋白属于I型；Ⅱ型RIP是二聚体蛋白，如蓖麻毒素，不仅有一条能使核糖体失活的毒性多肽A链，而且还有一条结合多肽B链；Ⅲ型较少见。RIPs具有降血糖、抗生育、抗肿瘤、抗病毒以及治疗艾滋病等药理活性，有广阔的临床应用前景。目前，Lee-Huang等利用pRSET表达载体在大肠杆菌中表达了MAP30基因，发现非糖基化的重组MAP30与天然MAP30具有相同的活性，AraziT等(2002)报道用葫芦科植物的专用型病毒载体南瓜黄花病毒(ZYMV-AG1I)载体生产的重组MAP30蛋白同样具有抗病毒、抗肿瘤活性。国内学者周鹏(2005年)、黄乾明(2007)、詹金彪(2010)等也先后成功构建了α-MMC和MAP30的表达系统，并获得了具有生物活性的苦瓜核糖体失活蛋白。但核糖体失活蛋白不论是利用原核载体在大肠杆菌中表达亦或是用植物病毒载体系统表达，皆不能在哺乳动物细胞中表达，不能用于抗肿瘤的基因治疗。
技术实现思路
：针对上述不足，本专利技术的目的在于提供一种核糖体失活蛋白基因病毒载体构建及其在肿瘤细胞中表达活性蛋白的方法。为了达到上述目的，本专利技术的基础方案为：一种核糖体失活蛋白基因病毒载体构建及其在肿瘤细胞中表达活性蛋白的方法，包括以下步骤:步骤一、选取合适的核糖体失活蛋白，对其基因进行人源化密码子优化；步骤二、腺病毒载体构建与重组病毒包装：(1)野生型α-MMC基因克隆：将Wild-Type序列的获得以质粒为模板，设计引物进行PCR反应，酶切后克隆入pDC316-mCMV-EGFP腺病毒穿梭载体上，测序验证；(2)步骤一中密码子优化后序列进行全序列合成；(3)分别将野生型和优化后α-MMC基因插入到pDC316-mCMV-EGFP腺病毒穿梭载体上，测序验证；(4)分别将穿梭载体与腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染AdMax293细胞，同源重组成为含目的基因的野生型重组腺病毒和优化型重组腺病毒；步骤三、将步骤二步骤得到的重组腺病毒转染肿瘤细胞，使其在肿瘤细胞中表达活性蛋白，并检测抗肿瘤效应。进一步，步骤一中获得的核糖体失活蛋白为具有RNAN-糖苷酶活性，即在活性位点区域内具有高度保守的活性裂隙残基和二级结构，能作用于真核细胞大亚基28S导致核糖体失活，抑制蛋白质的生物合成，能对肿瘤细胞产生细胞毒作用而杀伤肿瘤。进一步，核糖体失活蛋白的基因可以选用α-苦瓜素、MAP30、β-苦瓜素、γ-苦瓜素、δ-苦瓜素，天花粉蛋白，美洲商陆蛋白，丝瓜毒蛋白以及肥皂草素等Ⅰ型核糖体失活蛋白以及Ⅱ型核糖体失活蛋白(如蓖麻毒蛋白A链)等基因中的任一一种。进一步，核糖体失活蛋白的基因为α-苦瓜素基因，包括野生型和优化型α-苦瓜素基因。进一步，所述A步骤中使用三种专业密码子优化软件同时对α苦瓜素成熟区进行哺乳动物密码子优化，分别是MaxCodonTMOptimizationProgram、DNAWorks、SyntheticGeneDesigner，综合各软件的优势得到理想的优化结果，提高了目的基因在哺乳动物细胞以及肿瘤细胞中的表达数量和表达效率。进一步，步骤二中腺病毒载体为哺乳动物细胞表达系统腺病毒载体，以及腺病毒、腺病毒、逆转录病毒和慢病毒等病毒载体中任意一种构建的核糖体失活蛋白运载体；本方案使用了哺乳动物细胞表达系统腺病毒载体，其他载体系统也具有相同的载体作用，因此，腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒和慢病毒等病毒载体构建核糖体失活蛋白运载体也适用。技术效果：本方案以α-苦瓜素基因为实验模型，构建含核糖体失活蛋白的基因表达病毒重组体，核糖体失活蛋白具有RNAN-糖苷酶活性，能失活肿瘤细胞的核糖体，抑制蛋白质合成而对肿瘤细胞产生细胞毒作用。与现有技术相比本方案方法可以使得目的蛋白表达数量和销量更高；表达后的毒理效应更显著，两种重组病毒对乳腺癌MCF-7细胞和宫颈癌Hela细胞皆有显著的细胞毒效应，优化型效果更为显著；两种重组病毒对乳腺癌MCF-7细胞和宫颈癌Hela细胞的生长有显著的抑制作用。本方案中核糖体失活蛋白皆具有RNAN-糖苷酶活性，因此，本专利技术含核糖体失活蛋白基因的重组病毒同样适用于乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌、膀胱癌、绒毛膜细胞癌、宫颈癌、滋养层细胞癌、黑色素瘤的细胞。附图说明:图1为本专利技术的流程示意图图2为本专利技术的α苦瓜素基因密码子优化前，氨基酸表达率分析示意图；图3为本专利技术的α苦瓜素基因密码子优化后偏好密码子，氨基酸表达率分析示意图；图4腺病毒穿梭载体图谱；图5为优化序列穿梭质粒载体pDC316-MMC-mCMV-EGFP酶切示意图；图6为优化序列穿梭质粒载体α苦瓜素基因测序验证示意图；图7为野生型序列穿梭质粒载体pDC316-MMCwt-mCMV-EGFP构建的PCR结果示意图；图8为pDC316-MMCwt-mCMV-EGFP腺病毒载体和PCR回收产物双酶切示意图；图9为野生型序列穿梭质粒载体pDC316-MMCwt-mCMV-EGFP的测序结果比对示意图；图10为两步法QPCR程序示意图；图11为野生型苦瓜素和优化密码子苦瓜素溶解曲线示意图；图12为293T细胞转染荧光图；图13为WB检测结果示意图；图14为空载腺病毒Adv-mCMV、重组腺病毒Adv-MMCwt和重组腺病毒Adv-MMC三种病毒感染乳腺癌MCF-7和宫颈癌Hela的结果示意图；图15为MTT法检测细胞的吸光度值(OD值)曲线示意图；图16为重组腺病毒感染肿瘤细胞5天后观察细胞病变结果示意图；图17重组病毒感染能显著抑制肿瘤细胞生长效果示意图。序列表简要说明：序列表(一)显示了α苦瓜素基因密码子优化后的核苷酸序列具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核糖体失活蛋白基因病毒载体构建及其在肿瘤细胞中表达活性蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤一、选取合适的核糖体失活蛋白，对其基因进行人源化密码子优化；/n步骤二、腺病毒载体构建与重组病毒包装：(1)野生型α-MMC基因克隆：将Wild-Type序列的获得以质粒为模板，设计引物进行PCR反应，酶切后克隆入pDC316-mCMV-EGFP腺病毒穿梭载体上，测序验证；(2)步骤一中密码子优化后序列进行全序列合成；(3)分别将野生型和优化后α-MMC基因插入到pDC316-mCMV-EGFP腺病毒穿梭载体上，测序验证；(4)分别将穿梭载体与腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染AdMax293细胞，同源重组成为含目的基因的野生型重组腺病毒和优化型重组腺病毒；/n步骤三、将步骤二步骤得到的重组腺病毒转染肿瘤细胞，使其在肿瘤细胞中表达活性蛋白，并检测抗肿瘤效应。/n

【技术特征摘要】
1.一种核糖体失活蛋白基因病毒载体构建及其在肿瘤细胞中表达活性蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、选取合适的核糖体失活蛋白，对其基因进行人源化密码子优化；
步骤二、腺病毒载体构建与重组病毒包装：(1)野生型α-MMC基因克隆：将Wild-Type序列的获得以质粒为模板，设计引物进行PCR反应，酶切后克隆入pDC316-mCMV-EGFP腺病毒穿梭载体上，测序验证；(2)步骤一中密码子优化后序列进行全序列合成；(3)分别将野生型和优化后α-MMC基因插入到pDC316-mCMV-EGFP腺病毒穿梭载体上，测序验证；(4)分别将穿梭载体与腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染AdMax293细胞，同源重组成为含目的基因的野生型重组腺病毒和优化型重组腺病毒；
步骤三、将步骤二步骤得到的重组腺病毒转染肿瘤细胞，使其在肿瘤细胞中表达活性蛋白，并检测抗肿瘤效应。


2.根据权利要求1所述的一种核糖体失活蛋白基因病毒载体构建及其在肿瘤细胞中表达活性蛋白的方法，其特征在于，步骤一中选取的核糖体失活蛋白为具有RNAN-糖苷酶活性，在活性位点区域内具有高度保守的活性裂隙残基和二级结构，作用于真核细胞大亚基28S导致核糖体失活，抑制蛋白质的生物合成。


3.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘梦铃，
申请(专利权)人：成都富岱生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51