一种核糖体失活蛋白基因病毒载体构建及其在肿瘤细胞中表达活性蛋白的方法技术

本专利申请属于生物工程技术领域，具体公开了一种核糖体失活蛋白基因病毒载体构建及其在肿瘤细胞中表达活性蛋白的方法，包括如下步骤：步骤一、选取合适的核糖体失活蛋白，对其成熟区基因进行人源化表达的密码子优化；步骤二、野生型及优化后基因的腺病毒载体构建与重组病毒包装；步骤三、重组腺病毒感染肿瘤细胞，并检测使其在肿瘤细胞中蛋白表达及其抗肿瘤效应。本方案将α‑苦瓜素基因进行密码子优化，构建能感染哺乳动物肿瘤细胞的腺病毒表达载体系统，以适合于在肿瘤细胞中表达活性蛋白，克服了现有技术中使用原核细胞表达体系只能在大肠杆菌中表达以及使用植物病毒载体只能在植物细胞中表达而不能在肿瘤细胞中表达和杀伤肿瘤的缺陷。

Construction of a ribosome inactivating protein gene virus vector and its expression in tumor cells

【技术实现步骤摘要】
一种核糖体失活蛋白基因病毒载体构建及其在肿瘤细胞中表达活性蛋白的方法
：本专利技术申请属于生物工程
，更具体的说是涉及一种核糖体失活蛋白基因病毒载体构建及其在肿瘤细胞中表达活性蛋白的方法。
技术介绍
：核糖体失活蛋白(RibosomeInactivatingProteins，RIPs)是一类主要分布于植物体内的毒蛋白，具有RNAN-糖苷酶活性。RIPs在活性位点区域内具有高度保守的活性裂隙残基和二级结构，能作用于真核细胞大亚基28S导致核糖体失活，抑制蛋白质的生物合成，从而对细胞产生细胞毒作用。RIPs分为三种类型，I型RIP是单肽链蛋白，分子量大约1l～30可kDa，如苦瓜核糖体失活蛋白、天花粉蛋白(TCS)、美洲商陆蛋白(PAP)、丝瓜毒蛋白(1uffin)、肥皂草素等，大多数核糖体失活蛋白属于I型；Ⅱ型RIP是二聚体蛋白，如蓖麻毒素，不仅有一条能使核糖体失活的毒性多肽A链，而且还有一条结合多肽B链；Ⅲ型较少见。RIPs具有降血糖、抗生育、抗肿瘤、抗病毒以及治疗艾滋病等药理活性，有广阔的临床应用前景。>目前，Lee-Hu本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核糖体失活蛋白基因病毒载体构建及其在肿瘤细胞中表达活性蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤一、选取合适的核糖体失活蛋白，对其基因进行人源化密码子优化；/n步骤二、腺病毒载体构建与重组病毒包装：(1)野生型α-MMC基因克隆：将Wild-Type序列的获得以质粒为模板，设计引物进行PCR反应，酶切后克隆入pDC316-mCMV-EGFP腺病毒穿梭载体上，测序验证；(2)步骤一中密码子优化后序列进行全序列合成；(3)分别将野生型和优化后α-MMC基因插入到pDC316-mCMV-EGFP腺病毒穿梭载体上，测序验证；(4)分别将穿梭载体与腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre...

【技术特征摘要】
1.一种核糖体失活蛋白基因病毒载体构建及其在肿瘤细胞中表达活性蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、选取合适的核糖体失活蛋白，对其基因进行人源化密码子优化；
步骤二、腺病毒载体构建与重组病毒包装：(1)野生型α-MMC基因克隆：将Wild-Type序列的获得以质粒为模板，设计引物进行PCR反应，酶切后克隆入pDC316-mCMV-EGFP腺病毒穿梭载体上，测序验证；(2)步骤一中密码子优化后序列进行全序列合成；(3)分别将野生型和优化后α-MMC基因插入到pDC316-mCMV-EGFP腺病毒穿梭载体上，测序验证；(4)分别将穿梭载体与腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染AdMax293细胞，同源重组成为含目的基因的野生型重组腺病毒和优化型重组腺病毒；
步骤三、将步骤二步骤得到的重组腺病毒转染肿瘤细胞，使其在肿瘤细胞中表达活性蛋白，并检测抗肿瘤效应。


2.根据权利要求1所述的一种核糖体失活蛋白基因病毒载体构建及其在肿瘤细胞中表达活性蛋白的方法，其特征在于，步骤一中选取的核糖体失活蛋白为具有RNAN-糖苷酶活性，在活性位点区域内具有高度保守的活性裂隙残基和二级结构，作用于真核细胞大亚基28S导致核糖体失活，抑制蛋白质的生物合成。


3.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘梦铃，
申请(专利权)人：成都富岱生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51