一种检测乙肝表面抗原的磁性免疫层析试纸条及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种检测血液中乙肝表面抗原的磁性免疫层析试纸条及其制备方法。该试纸条是将包被膜、结合了乙肝表面抗体的磁颗粒垫、样品垫、吸水垫依次相互交错２ｍｍ地粘贴在底板上、然后在上层覆盖透明塑料密封膜组装而成的。包被膜上预包被有乙肝表面抗原检测线和质控线，本发明专利技术将磁性免疫层析技术和异硫氰酸荧光素系统引入到乙肝表面抗原检测中，操作简便，灵敏度高，特异性好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医学检验领域，特别是涉及一种检测乙肝表面抗原的磁性免疫层析试纸条及其制备方法。
技术介绍
肝炎是一个通用的术语，含义是肝脏的炎症，它可以由一系列不同的病毒引起，例如A型、B型、C型、D型和E型肝炎病毒。在引起人类肝炎的众多病毒中，乙型肝炎病毒(HBV)最具有全球影响性。 乙型肝炎由乙型肝炎病毒(HBV)引起，HBV是一种包含部分双链环状DNA基因组的包膜病毒，属于肝DNA病毒科。当病毒在肝细胞中复制时，可以干扰肝脏的功能，随即免疫系统激活产生一系列特异的反应以对抗并根除传染性因素。作为一种病理性损伤的结果，肝脏发生炎症。持续的HBV感染导致的严重的病理学结果包括慢性肝脏功能不全，肝硬化和肝细胞癌(HCC)。 乙肝表面抗原(HBsAg)是一种异质性抗原，具有一个共同的抗原，命名为a，以及两对突变的互斥性抗原d和y，w和r (包括几个亚决定簇)。因而，HbsAg有4种主要的亚型adw， ayw， adr禾口 ayr。 HBsAg几种亚型的分布具有地域性的特点。在美国、北欧、亚洲和大洋州，d决定簇比较常见，但是y决定簇出现的频率稍少。在日本人口中，d决定簇占绝大多数，y决定簇极少。在非洲和澳洲土著中，y决定簇常见，而d决定簇很少。Y决定簇也经常出现于印度和环地中海地区。在欧洲、美国、非洲、印度、澳大利亚和大洋州，w决定簇占优势。在日本、中国和东南亚，r亚型占优势。adw，ady和adr亚型每一个都在世界的广大地区分布。而ayr亚型在世界上较罕见，只是在大洋州的少量人口中常见。 由于共同决定簇的存在，对一种亚型的保护似乎可以将这种保护作用传递给其他亚型。并且在临床特征上，各亚型间没有区别。 目前的HBsAg病原学诊断技术主要包括酶联免疫试验(ELISA)、化学发光(CLIA)、免疫层析法(胶体金或乳胶颗粒法)、PCR法，这些方法都有各自的特点和使用对象。 ELISA法是目前临床血液筛查中普遍使用检测技术，但是ELISA试验操作程序复杂，容易出现假阳性或假阴性结果，且灵敏度低，CLIA与ELISA方法类似，只是灵敏度提高了一些，并没有根本解决ELISA存在的问题，并且二者都存在操作繁琐，反应时间长的问题，而且都需要酶标仪或发光仪和洗板机以及温箱等复杂设备，而且不能单人份检测，进一步限制了他们在一些基层医院、诊所的应用。近几年国内外出现了以胶体金或乳胶颗粒为代表的快速检测试纸条，但是由于结果是肉眼目视观察，容易受观察者主观判断的影响，灵敏度低，结果准确度也不高，检测窗口期较长。 PCR方法需要很高的试验工作环境和条件(无菌操作间，超净工作台)及大量的仪器设备(培养箱，离心机，PCR仪等)，并且操作极其复杂，需要受过严格专业训练的人员操3作，且试验周期很长，因此不适合用于临床检测用。 磁性免疫层析(Mgnetic ImmunoChromatographic Test，MICT)是近年来出现的一种单人份快速定量检测技术。是以超顺磁性颗粒(superPMPs)代替传统的标记物(胶体金，乳胶颗粒等)来进行免疫层析，通过检测结合在超顺磁性纳米微粒上的生化物质来提供对生物样品的定量检测数据。通过检测磁场强度来表达标记在样品区域的量，采用标记的免疫复合物-磁场强度的标准曲线，从而达到定量的目的。该技术与传统技术相比具有下述优势a.所用磁性检测仪器采用固相元件，微型化设计自成一体，独立运行，体积小，操作简便；b.灵敏度比各类目测快速诊断法高10-100倍；c.分析速度可在15秒内测量到多达6个分析位点的数据；d.线形范围在4个数量级浓度范围内呈线性；e.超顺磁性纳米微粒由聚合物包被，不会随时间而衰变。该技术继承了传统免疫层析法(胶体金，乳胶颗粒等)简便快速，单人份操作的优点，又弥补了传统免疫层析技术灵敏度低，只能定性，不能定量的缺点，代表了当今即时检验(Point of Care Test，P0CT)技术发展的方向和潮流， 一经问世，发展迅速，目前已经成为替代传统免疫层析技术的首选。 目前常用的标记磁颗粒为超顺磁颗粒(superPMPs)，没有外加磁场的情况下不具有任何磁性，只有在外加磁场作用下才会表现出磁性，商品化超顺磁颗粒都经过表面修饰，大大方便了标记过程，标记简便，重复性好。 将异硫氰酸荧光素系统引入磁性免疫层析中，既提高了检测方法的灵敏度，又提供了一种通用技术平台，增加了工艺的通用性，减少了系统因素的影响。
技术实现思路
本专利技术的目的即是将磁性免疫层析技术与异硫氰酸荧光素系统联合应用在HBsAg免疫分析中。将抗FITC抗体共价偶联于超顺磁颗粒上，将FITC化HBsAb与之混合之后作为检测流动相，将HBsAb包被于硝酸纤维素膜上制成检测线作为捕获固相，按照常规免疫层析法的原理进行标本的检测，结合简便易行的磁性检测仪进行检测，在实现高灵敏度检测的同时又能大大縮短检测的窗口期，可以避免前述几种检测方法的不足，又综合了前述几种方法的优势可以单人份检测，也可以批量检测，并且可以即时给出定量结果，测量仪器简单可靠，操作简便，方便实用。 为达到上述的目的，本专利技术的技术方案如下本专利技术的检测乙肝表面抗原的磁性免疫层析试纸条是将包被膜、结合HBsAb的磁颗粒垫、样品垫、吸水垫、依次相互交错2mm地粘贴在底板上，然后在上层覆盖透明塑料密封膜而制成，其中所述的包被膜上预包被有HBsAb检测线，以及FITC化牛血清白蛋白的质控线。 选用的底板为透明塑料底板，包被膜为35mm宽度的硝酸纤维素膜，选用的吸水垫为纤维素膜，磁颗粒垫为玻璃纤维垫，样品垫为经过样品垫处理液预处理的纤维素膜。所述的样品垫处理液是含有1% _5%酪蛋白(casein)和0. 1% _1%的聚乙烯醇(PVP)，以及0. 01-0. 2%吐温-20 (Tween-20)的0. 02M，pH7. 0-7. 6的磷酸盐缓冲溶液(PBS)。检测乙肝表面抗原的磁性免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤 A、磁颗粒的制备选用直径为100-300nm的超顺磁颗粒，使用碳二亚胺(EDC)和琥珀酰亚胺(NHS)共价偶联的方式将抗FITC抗体标记到磁颗粒上，选用FITC进行HBsAb的标记，将标记好的FITC化HBsAb以1 : 3-1 10的比例(体积比)与抗FITC抗体磁颗粒混合，确保抗FITC抗体磁颗粒过量； B、将制备好的磁颗粒使用定量喷液装置以25 iU/cm-50 ill/cm的量喷涂于磁颗粒垫上；C、包被膜的制备使用包被缓冲液分别将HBsAb以及FITC化BSA稀释到0. 5_2mg/m的浓度，使用定量喷液装置分别将三者以0. 5-1. 0cm的间隔于硝酸纤维素膜上，晾干后于封闭液中浸泡10分钟后于25-35t:烘干8小时，加入干燥剂封存备用； D、样品垫的处理将样品垫放入样品垫处理溶液中浸泡处理1小时后取出25-35t:烘干8小时； E、试纸条的组装在透明塑料底板上依次相互交错2mm贴上包被膜、磁颗粒垫、样品垫、吸水垫，然后在上层覆盖透明塑料密封膜，得到试纸板，根据要求宽度切割即得到试纸条。所述的步骤A包括以下三步 1)抗FITC抗体磁颗粒的制备使用含有0. 1 % Tween-20的50mM， pH7. 0-7. 6的PBS洗涤磁颗粒，加入EDC，室温反应本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测乙肝表面抗原的磁性免疫层析试纸条，其特征在于：该试纸条是将包被膜、结合了乙肝表面抗体的磁颗粒垫、样品垫、吸水垫依次相互交错２ｍｍ地粘贴在底板上，然后在上层覆盖透明塑料密封膜组装而成，其中所述的包被膜上预包被有乙肝表面抗原检测线和质控线。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：唐宝军，应希堂，李强，胡国茂，郑金来，于尚永，
申请(专利权)人：北京科美东雅生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]