截短的VWF对FVIII免疫原性的调节制造技术

本发明专利技术涉及重组多肽，其包含能够与凝血因子VIII(FVIII)结合的截短的冯维勒布兰德因子(VWF)，用于降低因子VIII(FVIII)的免疫原性，其中向患有凝血障碍的受试者共施用所述重组多肽和凝血因子VIII(FVIII)蛋白。本发明专利技术还涉及用于所述用途的药物组合物和试剂盒。

Regulation of FVII immunogenicity by truncated VWF

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】截短的VWF对FVIII免疫原性的调节专利
本专利技术涉及包含能与凝血因子VIII(FVIII)结合的截短的冯维勒布兰德因子(vonWillebrandfactor,VWF)的重组多肽用于降低因子VIII(FVIII)的免疫原性，其中向患有凝血障碍的受试者共施用所述重组多肽和因子VIII(FVIII)蛋白。专利技术背景存在由凝血因子缺乏引起的各种出血性病症。最常见的病症是分别由凝血因子VIII和IX缺乏引起的A和B型血友病。另一个已知的出血性病症是冯维勒布兰德氏病(vonWillebrand’sdisease,VWD)。A型血友病是遗传性出血性病症。其是由X染色体连锁的凝血因子VIII缺乏引起的，几乎只影响男性，发病率为每10.000人中1至2个人。X染色体缺陷是由本身不是血友病的女性携带者传递的。A型血友病的临床表现是出血倾向增加。在引入凝血因子VIII浓缩物治疗之前，重度血友病患者的平均寿命小于20岁。来自血浆的凝血因子VIII的浓缩物的使用可大大改善A型血友病患者的状态，大大延长平均寿命，从而使他们中的大多数人可能或多或少地享有正常生活。然而，血浆衍生浓缩物及其使用存在某些问题，其中最严重的是病毒的传播。迄今为止，引起乙型肝炎、非甲型非乙型肝炎和AIDS的病毒已严重打击了民众。从那时起，最近开发了不同的病毒灭活方法和新的高度纯化的因子VIII浓缩物，其也为血浆源性因子VIII建立了非常高的安全标准。凝血因子VIII的cDNA的克隆(Wood等，1984.Nature312:330-336；Vehar等1984.Nature312:337-342)使得重组表达因子VIII成为可能，从而导致了几种重组因子VIII产品的开发，其在1992年至2003年间获得了监管机构的批准。位于氨基酸Arg-740与Glu-1649之间的因子VIII多肽链的中央B结构域对于完整的生物学活性似乎并非必需的事实也导致了缺失B结构域的因子VIII产品的开发。成熟的因子VIII分子由2332个氨基酸组成，其可分为三个同源的A结构域、两个同源的C结构域和一个B结构域，它们的排列顺序为：A1-A2-B-A3-C1-C2。在其分泌到血浆期间，由于单链因子VIII在B-A3边界和B结构域内的不同位点被切割，因此因子VIII在细胞内被加工成一系列金属离子连接的异二聚体。这种加工导致由A1、A2和B结构域的各个部分组成的异质重链分子，其分子大小在90kDa至200kDa范围内。重链通过金属离子与轻链结合，所述轻链由A3、C1和C2结构域组成(Saenko等2002.VoxSang.83:89-96)。在血浆中，此异二聚因子VIII以高亲和力与冯维勒布兰德因子(vWF)结合，从而保护其免于过早分解代谢。与vWF结合的未活化因子VIII在血浆中的半衰期约为12小时。VWF是存在于哺乳动物血浆中的多聚体粘附糖蛋白，具有多种生理功能。在初期止血过程中，VWF充当血小板表面上的特定受体与细胞外基质成分(诸如胶原蛋白)之间的介体。此外，VWF用作促凝剂FVIII的载体和稳定蛋白。VWF在内皮细胞和巨核细胞中合成为2813个氨基酸的前体分子。野生型VWF的氨基酸序列和cDNA序列公开于Collins等1987,ProcNatl.Acad.Sci.USA84:4393–4397中。前体多肽，即前VWF原由22个残基的信号肽、741个残基的肽原和在成熟血浆VWF中发现的2050个残基的多肽组成(Fischer等，FEBSLett.351:345-348,1994)。一旦分泌到血浆中，蛋白酶ADAMTS13就在VWF的A1结构域内切割VWF。在血浆中，FVIII以高亲和力结合vonVWF，从而保护其免于过早分解代谢，因此，除了其在初期止血中的作用外，其还对调节血浆FVIII的水平起着至关重要的作用，因此其也是控制次级止血的中心因素。在血浆中与VWF结合的未活化FVIII的半衰期约为12至14小时。在其中不存在或几乎不存在VWF的3型冯维勒布兰德疾病中，FVIII的半衰期仅为约6小时，由于FVIII浓度降低，导致此类患者中出现轻度至中度A型血友病症状。VWF对FVIII的稳定作用也已经用于辅助FVIII在CHO细胞中的重组表达(Kaufman等，MolCellBiol9:1233-1242,1989)。未与VWF结合的游离FVIII在循环中的半衰期约为2小时(Vlot等,ThrombHaemost2000；83:65–91)。在经受预防性治疗的严重A型血友病患者中，由于凝血因子VIII的血浆半衰期(约为12小时)短，因此必须每周静脉内(i.v.)施用凝血因子VIII约3次。每次i.v.施用很麻烦，伴有疼痛，并有感染的危险，尤其是因为这主要是由患者本人或被诊断出患有A型血友病的孩子的父母在家中完成的。因此，非常需要产生具有增加的功能半衰期的因子VIII，从而允许制造必须以更低频率施用的含有因子VIII的药物组合物。已经描述了在体外和体内稳定FVIII的VWF源性多肽，特别是VWF片段。WO2013/106787A1涉及包含某些VWF片段和FVIII蛋白的嵌合蛋白。FVIII和VWF片段的那些嵌合异二聚体确实具有1:1的VWF与FVIII的固定摩尔比。WO2014/198699A2和WO2013/083858A2描述了VWF片段及其在血友病治疗中的用途。已经发现，在与相似摩尔量的VWF片段血管外共施用时，FVIII的生物利用度可得到显著提高。Yee等(2014)Blood124(3):445-452发现，含有D’D3结构域的VWF片段足以在VWF缺陷小鼠中稳定因子VIII。WO2016/188907A1中公开了一种通过共施用截短的VWF来提供因子VIII的延长的体内半衰期的方法。然而，多达30％的A型血友病患者的主要并发症是抑制剂(尤其是同种异体抗体)的出现，所述抑制剂使FVIII活性失活并且可使替代疗法失效。已经描述过，当用重组FVIII产品治疗时，以前未经治疗的A型血友病患者中FVIII抑制剂生成的风险较高，并且推测VWF与FVIII-LC中的不同表位(A3和C2结构域)结合屏蔽了这些表位，因此可能在降低免疫原性方面具有有益作用(C.EscuriolaEttinghausen,W.Kreuz；Haemophilia(2006),12,(增刊6),102-106)。FVIII的未屏蔽表位似乎具有引发抑制剂生成的风险。另外，推测FVIII-HC和FVIII-LC在双链FVIII复合物中的相互作用也对FVIII-HC和FVIII-LC中原本可自由接近的表位具有遮蔽作用。重度A型血友病患者中中和性抗因子VIII同种抗体(抑制剂)的发展可取决于用于替代治疗的浓缩物。用含有冯维勒布兰德因子的血浆源性因子VIII治疗的患者相较于用重组因子VIII治疗的患者具有更低的抑制剂发生率。与使用pdFVIII治疗的患者相比，使用重组FVIII治疗的年幼男孩(年龄<6岁，严重A型血友病，并且之前未曾使用任何因子VIII浓缩物进行过治疗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.包含能够与凝血因子VIII(FVIII)结合的截短的冯维勒布兰德因子(VWF)的重组多肽，用于降低因子VIII(FVIII)的免疫原性，其中向患有凝血障碍的受试者共施用所述重组多肽和凝血因子VIII(FVIII)蛋白。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170622 EP 17177477.1;20180126 EP 18153579.01.包含能够与凝血因子VIII(FVIII)结合的截短的冯维勒布兰德因子(VWF)的重组多肽，用于降低因子VIII(FVIII)的免疫原性，其中向患有凝血障碍的受试者共施用所述重组多肽和凝血因子VIII(FVIII)蛋白。


2.根据权利要求1使用的重组多肽，其中所述FVIII的降低的免疫原性包括受试者针对FVIII的体液免疫反应降低，特别是针对FVIII的抑制性抗体的滴度和/或频率较低，和/或针对FVIII的细胞介导的免疫反应降低。


3.根据前述权利要求中任一项使用的重组多肽，其中优选地当与参考治疗相比时，在共施用的重组多肽存在的情况下，实现了施用后FVIII的免疫原性降低或者所述FVIII的免疫原性降低伴随着FVIII至受试者的抗原呈递细胞(APC)中的摄入减少，其中除在不共施用所述重组多肽的情况下施用所述FVIII外，所述参考治疗与所述治疗相同。


4.根据权利要求3使用的重组多肽，其中当与参考治疗相比时，在共施用所述重组多肽和FVIII后，所述受试者中具有内化FVIII的APC的部分减少至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍，其中除在不共施用所述重组多肽的情况下施用所述FVIII外，所述参考治疗与所述治疗相同。


5.根据权利要求3或4使用的重组多肽，其中当与全长VWF的相应IC50值相比时，基于所述单体的摩尔浓度计算，所述共施用的重组多肽的IC50值仅适度增加，所述IC50值表示抑制FVIII至APC中的摄入的潜力，优选地，所述共施用的重组多肽的IC50值确实超过全长VWF的IC50值不超过3倍，不超过2.5倍，不超过2.4倍，不超过2.3倍，不超过2.2倍，不超过2.1倍，不超过2.0倍，不超过1.8倍，不超过过1.5倍，不超过1.3倍，不超过1.2倍或不超过1.1倍。


6.根据权利要求3或4使用的重组多肽，其中当与全长VWF的相应IC50值相比时，所述共施用的重组多肽的IC50值相同或甚至减小，所述IC50值以所述单体的摩尔浓度计，表示抑制FVIII至APC中的摄入的潜力，优选地与全长VWF的IC50值相比，所述共施用的重组多肽的IC50值减小至少1.2倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍或至少3倍。


7.根据前述权利要求中任一项使用的重组多肽，其中当与参考治疗相比时，在所述重组多肽存在的情况下，实现了在施用所述重组多肽后FVIII免疫原性的降低或者所述FVIII免疫原性的降低伴随着受试者的抗原呈递细胞(APC)对FVIII肽的II类MHC抗原呈递淬灭，其中除在不施用所述重组多肽的情况下施用所述FVIII外，所述参考治疗与所述治疗相同，其中所述受试者的抗原呈递细胞(APC)对FVIII肽的所述II类MHC抗原呈递优选被淬灭，即降低至少1.5倍、至少2.0倍、至少2.5倍、至少3.0倍、至少3.5倍或至少4.0倍。


8.根据前述权利要求中任一项使用的重组多肽，其中所述受试者是先前未用FVIII治疗的受试者。


9.根据前述权利要求中任一项使用的重组多肽，其中所述受试者具有产生针对FVIII的免疫反应，特别是特征在于针对FVIII的抑制性抗体的免疫反应的风险，和/或预期发生所述免疫反应。


10.根据前述权利要求中任一项使用的重组多肽，其中共施用所述重组多肽和FVIII以预防或治疗患有凝血障碍的受试者。


11.根据前述权利要求中任一项使用的重组多肽，其中所述FVIII的免疫原性降低的特征在于针对FVIII的抑制性抗体的滴度更低，优选地，当与在参考治疗后受试者中的FVIII抗体的滴度相比时，所述针对FVIII的抑制性抗体的滴度降低至少2％，至少5％，至少10％，至少15％...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·韦尔哈根，S·佩斯特尔，T·魏默，M·霍夫曼，H·许恩，E·马拉斯科夫斯基，
申请(专利权)人：康诺贝林伦瑙有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH