用于增加凝血因子VIII的体外稳定性的截短的血管性血友病因子(VWF)制造技术

本发明专利技术涉及包含截短的血管性血友病因子(VWF)的多肽用于增加凝血因子VIII(FVIII)在包含所述FVIII和所述多肽的组合物中的体外稳定性的用途，其中所述多肽与所述FVIII在组合物中的摩尔比大于20。物中的摩尔比大于20。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于增加凝血因子VIII的体外稳定性的截短的血管性血友病因子(VWF)
专利

[0001]本专利技术涉及用于改善凝血因子VIII(FVIII)的体外稳定性的方法，具体而言，涉及包含截短的血管性血友病因子(VWF)的多肽用于增加凝血因子VIII(FVIII)的体外稳定性的用途。
[0002]专利技术背景
[0003]因子VIII(FVIII)是一种在血浆中发现的蛋白质，它在导致血液凝固的级联反应中充当辅助因子。血液中FVIII活性量的缺陷导致称为血友病A的凝血障碍，这是一种主要影响男性的遗传性疾病。目前采用来源于人血浆或使用重组DNA技术制造的FVIII治疗制剂治疗血友病A。一般来说，这种制剂要么对出血事件作出反应(按需治疗)，要么以频繁、定期的间隔施用，以防止不受控制的出血(预防)。
[0004]已知FVIII在治疗制剂中相对不稳定。在血浆中，FVIII通常与另一种血浆蛋白血管性血友病因子(VWF)复合，VWF被认为可以保护FVIII免于过早降解。目前销售的FVIII制剂通常依赖于使用白蛋白和/或天然VWF在制造过程中和储存期间稳定FVIII。
[0005]已经描述了几种在没有白蛋白或天然VWF(或这些赋形剂水平相对较低)的情况下配制FVIII的尝试。例如，美国专利号5,565,427(EP 0 508 194)描述了这样的FVIII制剂，除了氯化钠和蔗糖等赋形剂外，其还含有洗涤剂和氨基酸、特别是精氨酸和甘氨酸的特定组合。
[0006]美国专利号5,763,401(EP 0 818 204)也描述了一种治疗性FVIII制剂，其包含15
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60mM蔗糖，至多50mM NaCl，至多5mM氯化钙，65
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400mM甘氨酸和至多50mM组氨酸。
[0007]美国专利号5,733,873(EP 627 924)描述了包括0.01
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1mg/ml的表面活性剂的制剂。还描述了使用低或高浓度氯化钠的其他尝试。美国专利号4,877,608(EP 0 315 968)公开了氯化钠浓度相对较低即0.5mM至15mM NaCl的制剂。另一方面，美国专利号5,605,884(EP 0 314 095)教导使用氯化钠浓度相对较高的制剂。
[0008]其他FVIII制剂描述于WO 2010/054238、EP 1 712 223、WO 2000/48635、WO 96/30041、WO 96/22107、WO 2011/027152、EP 2 361 613、EP 0 410 207、EP 0 511 234、US 5565427、EP 0 638 091、EP 0 871 476、EP 0 819 010、US 5874408、US 2005/0256038、US 2008/0064856、WO 2005/058283、WO 2012/037530和WO 2014/026954中。
[0009]VWF来源的多肽，特别是VWF片段，已被描述可以在体内改善FVIII的生物利用度。WO 2013/106787 A1涉及包含FVIII蛋白和某些VWF片段的嵌合蛋白。那些FVIII和VWF片段的嵌合异二聚体确实具有1:1的VWF与FVIII的固定摩尔比。
[0010]WO 2014/198699 A2和WO 2013/083858 A2描述了VWF片段及其在血友病治疗中的用途。已经发现，在血管外与相似摩尔量的VWF片段共施用时，FVIII的生物利用度可得到显著改善。WO 2018/087271 A1和WO 2016/188907 A1描述了用于治疗或预防血友病的截短的VWF多肽。WO 2016/000039 A1、WO 2017/117630 A1和WO 2017/117631A1描述了能够与FVIII结合的修饰的VWF多肽。
[0011]WO 2011/060242 A2公开了包含某些VWF片段和抗体Fc区的融合多肽，其建议了至多10:1的VWF片段与FVIII的特定摩尔比。此外，没有提供关于所述Fc融合构建体的体内数据。
[0012]Yee et al.(2014)Blood 124(3):445
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452发现，含有融合至免疫球蛋白G1的Fc部分的D'D3结构域的VWF片段足以稳定VWF缺陷小鼠中的内源性因子VIII。因此，在VWF缺陷小鼠中，FVIII的内源性表达率增加或内源性表达FVIII的消除率降低。然而，尽管VWF D'D3
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Fc融合蛋白在输注到FVIII缺陷小鼠体内时表现出显著延长的存活期，但VWF D'D3
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Fc融合蛋白并没有延长共输注FVIII的存活期。
[0013]WO 2015/185758 A2描述了包含FVIII和一种或多种VWF肽的复合物的组合物，其中VWF肽至少包含人VWF(UniProtKB
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P04275)的氨基酸764至1035和1691至1905，但不含人VWF的氨基酸2255至2645。通过用金黄色葡萄球菌(S.aureus)V
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8蛋白酶消化血浆来源的VWF，制备了由人VWF的氨基酸764
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2128组成的VWF片段(“片段III”)。该片段与胶原蛋白III和肝素结合。在根据片段III单体亚基计算以五倍摩尔过量加入时，片段III稳定溶液中rFVIII。WO 2015/185758A2没有显示缺乏氨基酸1691至1905的VWF肽的稳定作用。WO 2015/185758 A2没有公开任何大于20的VWF肽与FVIII的比例。
[0014]继续存在对在体外稳定FVIII制剂的方式和方法的需要。
[0015]专利技术概述
[0016]本申请的专利技术人出乎意料地发现，包含VWF的D
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D3结构域的VWF片段在体外增加FVIII的稳定性，其中VWF片段与FVIII的摩尔比大于20。
[0017]因此，本专利技术涉及在以下项目[1]至[80]中定义的主题：
[0018][1]包含截短的血管性血友病因子(VWF)的多肽用于增加包含凝血因子VIII(FVIII)和所述多肽的组合物中所述FVIII的体外稳定性的用途，其中组合物中所述多肽与所述FVIII的摩尔比大于20。
[0019][2]根据项目[1]所述的用途，其中所述多肽增加所述FVIII的储存稳定性。
[0020][3]根据项目[1]或[2]所述的用途，其中所述组合物不含蛋白酶。
[0021][4]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述组合物不含野生型VWF。
[0022][5]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述FVIII是重组产生的FVIII或者是血浆来源的FVIII。
[0023][6]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述摩尔比是至少50。
[0024][7]根据前述项目中任一项所述的用途，其中所述摩尔比大于50。
[0025][8]根据前述项目中任一项本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.包含截短的血管性血友病因子(VWF)的多肽用于增加包含凝血因子VIII(FVIII)和所述多肽的组合物中所述FVIII的体外稳定性的用途，其中所述组合物中所述多肽与所述FVIII的摩尔比大于20。2.根据权利要求1所述的用途，其中所述多肽增加所述FVIII的储存稳定性。3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述组合物中所述多肽与所述FVIII的摩尔比大于50。4.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述组合物不含野生型VWF。5.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述FVIII是重组产生的FVIII或者是血浆来源的FVIII。6.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述用途包括向所述FVIII添加超过20倍摩尔过量的所述多肽，从而稳定所述FVIII。7.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中冷冻干燥和复原包含所述FVIII和所述多肽的组合物后FVIII的产率大于冷冻干燥和复原缺乏所述多肽的对照组合物后FVIII的产率。8.根据权利要求7所述的用途，其中在冷冻干燥后立刻复原经冷冻干燥的组合物。9.根据权利要求1至6中任一项所述的用途，其中包含所述FVIII和所述多肽的冷冻干燥的组合物在25℃储存期间FVIII活性损失小于缺乏所述多肽的冷冻干燥的对照组合物的FVIII活性损失。10.根据权利要求9所述的用途，其中所述储存持续12个月的时间段。11.根据权利要求1至6中任一项所述的用途，其中在25℃储存一周后，包含所述多肽和所述FVIII的液体组合物中FVIII活性大于缺乏所述多肽的对照组合物的FVIII活性。12.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述多肽以1nM或更小的解离常数K
D
结合所述FVIII。13.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中所述截短的VWF包含SEQ ID NO:4的氨基酸764至1...

【专利技术属性】
技术研发人员：H，
申请(专利权)人：康诺贝林伦瑙有限公司，
类型：发明
国别省市：