因子IX变体及其在治疗中的用途制造技术

本发明专利技术提供了因子IX变体、包含变体的分子、编码变体的核酸、包含变体或编码变体的核酸的组合物，以及它们在调节止血的方法中例如在预防或治疗B型血友病中的用途。因子IX变体相对于其他因子IX变体和/或相对于野生型因子IX具有改进的生物学特性。IX具有改进的生物学特性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】因子IX变体及其在治疗中的用途


[0001]本专利技术涉及因子IX变体、编码变体的分子、编码变体的核酸、包含变体或编码变体的核酸的组合物以及它们在调节止血的方法中例如在治疗或预防凝血障碍例如B型血友病中的用途。
[0002]背景
[0003]人凝血因子IX(FIX)是凝血级联反应的关键组分。编码因子IX的基因中的某些功能丧失(loss
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of
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function)改变导致因子IX缺乏，从而导致出血性疾病B型血友病(也称为克雷司马斯病)，其通常需要因子IX替代疗法。
[0004]因子IX是一种单链糖多肽，分子量为57kDa。它在肝脏中合成并在46个氨基酸(aa)的前前肽(prepropeptide)的裂解后分泌到血流中。因子IX作为415个氨基酸的非活性酶原在血流中循环。它包含N末端Gla结构域，然后是两个表皮生长因子(EGF)结构域、一个活化肽和在C末端的胰蛋白酶型丝氨酸蛋白酶结构域。在血管损伤后，因子IX通过35
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aa活化肽在R145
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A146和R180
‑
V181处的蛋白水解被转化为其活性形式因子IXa，导致形成两条多肽链，N末端轻链(aa1
‑
145；18kDa)和C末端重链(aa181
‑
415；28kDa)，它们通过二硫键连接在一起。这种活化的因子IX在凝血级联反应中的作用是通过与Ca
2+
离子、膜磷脂和因子VIIIa的相互作用将因子X活化为其活性形式(因子Xa)。Xa因子裂解凝血酶原，其产生活性凝血酶。凝血酶将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，其交联以形成血凝块。
[0005]B型血友病是由无功能或缺失因子IX引起的，并且通常需要因子IX替代疗法，例如来自血浆的因子IX浓缩物或因子IX的重组形式。尽管有效，但一些目前的因子IX替代疗法受到所施用的因子IX多肽的半衰期短的影响，因此需要以高剂量频繁静脉注射。此外，蛋白质替代需要大量的因子IX多肽，这可能是昂贵的。因此，需要具有改善的生物学特性的因子IX多肽。具体而言，期望减少实现必需水平的因子IX活性所需的因子IX多肽的量。还期望降低施用频率，即增加施用之间的时间段。
[0006]本专利技术人已经发现在某些氨基酸位置相对于野生型因子IX多肽中那些位置的氨基酸具有取代的因子IX变体可能具有有利的特性，这使得它们特别适用于治疗或预防出血性疾病例如B型血友病。与野生型因子IX多肽相比，甚至与其他已知的因子IX变体相比，本专利技术的因子IX变体可能具有更高的促凝活性(“比活性”)。较高的比活性在预防和/或治疗中可能是有利的，因为需要施用较少的总因子IX多肽以实现与野生型因子IX或与具有较低的比活性的其他因子IX变体相同水平的因子IX活性。较高的比活性也可能是有利的，因为它允许更快的治疗反应(例如，在治疗急性出血事件时)。此外，具有较高的比活性的因子IX变体在基因治疗方法中可能特别有用，例如因为它们可以允许施用较低的病毒载体剂量，从而减少或避免在一些受试者中看到的抗载体免疫反应(例如抗衣壳细胞免疫)，同时仍然提供临床上显著水平的因子IX活性。
[0007]本专利技术人还显示了本专利技术的因子IX变体可以与半衰期增强剂连接(例如，通过可裂解的接头)，同时保持增加的因子IX活性的能力。因此，此类因子IX变体可能具有更长的体内功能半衰期以及在活化时更高的促凝血活性。这可能是特别有利的，因为达到与野生
型因子IX或其他因子IX变体相同水平的因子IX活性所需的总因子IX多肽更少，并且另外需要更少的施用频率(因为每次施用提供更长时间的具有增加的因子IX活性的因子IX多肽)。

技术实现思路

[0008]本专利技术提供相对于其他因子IX变体和/或相对于野生型因子IX具有改善的生物学特性的因子IX变体。特别地，如本文所述的因子IX变体相对于野生型因子IX和/或相对于其他因子IX变体可以具有更大的凝血活性(更大的比活性)。本专利技术还提供包含与半衰期增强剂连接的因子IX变体的分子，所述半衰期增强剂为因子IX变体提供更长的体内功能半衰期。本专利技术的因子IX变体和包含其的分子因此特别用于预防或治疗出血性疾病例如B型血友病。因子IX变体或包含其的分子通常是重组多肽。
[0009]一方面，本专利技术因此提供了包含因子IX变体多肽的分子，所述变体多肽在对应于野生型因子IX的410位的位置处包含氨基酸H(组氨酸)，或在对应于野生型因子IX的338位的位置处包含除R(精氨酸)之外的氨基酸。因此，本专利技术提供了例如在对应于野生型因子IX的338位的位置处包含氨基酸V(缬氨酸)、T(苏氨酸)或W(色氨酸)例如V或T特别是V的分子。
[0010]本领域技术人员将理解，多肽上下文中的术语“氨基酸”与“氨基酸残基”可互换使用。
[0011]编号是指在SEQ ID NO：1中鉴定的野生型因子IX中的氨基酸位置。例如，“包含在对应于SEQ ID NO：1的410位的位置处包含氨基酸H的因子IX变体多肽的分子”是指包含在对应于SEQ ID NO：1的410位(其在该位置具有氨基酸E)的位置处包含氨基酸H的因子IX变体多肽的分子，例如因子IX变体多肽在SEQ ID NO：1的410位包含氨基酸H。表明该特征的另一种方式是例如“410H”或“E410H”。
[0012]本专利技术还提供了包含因子IX变体多肽的分子，该变体多肽在对应于野生型因子IX的410位的位置处包含氨基酸H，并且在对应于野生型因子IX的338位的位置处包含除R之外的氨基酸。
[0013]对应于野生型因子IX的338位的氨基酸可以是相对于具有在338位处具有氨基酸R的相同序列的因子IX多肽增加因子IX变体多肽的比活性的任何氨基酸。比活性通常使用体外一阶段凝血测定确定，例如aPTT测定和其他方法是本领域技术人员已知的。在一个优选的实施方案中，因子IX活性是使用体外的基于aPTT的一阶段凝血测定确定的，通常如实施例3中所述。
[0014]因子IX变体多肽的相对比活性相对于具有在338位处具有氨基酸R的相同序列的因子IX多肽可以增加至少3倍或至少4倍(其中在每个多肽中，对应于410位的氨基酸是E)。
[0015]因子IX变体多肽的相对比活性相对于具有在338位处具有氨基酸R的相同序列的因子IX多肽可以增加至少2.5倍、至少3.0倍或至少3.5倍(其中在每个多肽中，对应于410位的氨基酸是H)。
[0016]当比较在对应于野生型因子IX的410位的位置处包含氨基酸H和在对应于野生型因子IX的338位的位置处包含除R之外的氨基酸的因子IX变体多肽时，因子IX变体多肽的相对比活性相对于具有在410位处具有氨基酸E和在338位处具有氨基酸R的相同序列的因子IX多肽可以增加至少5倍、至少6倍或至少7倍。在对应于野生型因子IX的410位的位置处包含氨基酸H和在对应于野生型因子IX的338位的位置处包含除R之外的氨基酸的因子IX变体
多肽的相对比活性因此相对于野生型因子IX(例如S本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种包含因子IX变体多肽的分子，所述因子IX变体多肽在对应于野生型因子IX的410位的位置处包含氨基酸H，并在对应于野生型因子IX的338位的位置处包含除R之外的氨基酸。2.根据权利要求1所述的分子，其在对应于野生型因子IX的338位的位置处包含选自V、T和W的氨基酸。3.根据权利要求1或权利要求2所述的分子，其在对应于野生型因子IX的338位的位置处包含选自V和T的氨基酸。4.根据前述权利要求中任一项所述的分子，其在对应于野生型因子IX的338位的位置处包含氨基酸V。5.根据前述权利要求中任一项所述的分子，其中所述因子IX变体多肽包含与SEQ ID NO：1具有至少70％的序列同一性例如至少80％、至少90％或至少95％的序列同一性的氨基酸序列。6.根据前述权利要求中任一项所述的分子，其中所述分子进一步包含半衰期增强部分，特别地其中所述半衰期增强部分选自：白蛋白，包括其变体和衍生物；白蛋白家族的多肽，包括其变体和衍生物；无抗原结合域的免疫球蛋白(例如Fc部分)；聚乙二醇；人绒毛膜促性腺激素的C末端肽(CTP)或非结构化重组多肽(例如XTEN)。7.根据权利要求6所述的分子，其中所述分子进一步包含在所述因子IX变体多肽和所述半衰期增强部分之间的可裂解肽接...

【专利技术属性】
技术研发人员：P，
申请(专利权)人：康诺贝林伦瑙有限公司，
类型：发明
国别省市：