使用烷基糖苷类进行蛋白质纯化和病毒灭活制造技术

纯化重组蛋白的方法，包括以下步骤：i)提供包含所述重组蛋白的溶液；ii)添加烷基糖苷到所述溶液中；和iii)纯化所述重组蛋白。烷基糖苷的添加提供了对与过程相关的杂质的清除改善。本发明专利技术的纯化的重组蛋白具有低水平的宿主细胞DNA、宿主细胞蛋白质和病毒污染。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用烷基糖苷类进行蛋白质纯化和病毒灭活
本专利技术属于重组表达多肽的领域，特别是这些多肽的纯化以用于药物用途。
技术介绍
重组表达的多肽的大规模、经济的纯化对于生物技术工业而言日益成为重要的问题。这些多肽是通过细胞培养产生的，通常使用哺乳动物、酵母或细菌细胞系，通过插入含有该多肽的基因的重组质粒，所述细胞系经工程改造以生产目的多肽。将所需多肽与细胞组分例如宿主细胞DNA和蛋白质分离至足以用作人用治疗剂的纯度构成一个艰巨的挑战。理想地，所使用的纯化技术将是可规模化的、有效的、具有成本效益的、可靠的，并且满足最终产品的任何纯度要求。当前的纯化技术通常涉及多次层析分离。典型的处理可能包括所有或至少一些以下步骤：沉淀，超滤，渗滤，免疫亲和以及亲和层析，阳离子交换层析，阴离子交换层析，疏水相互作用层析，多元层析，金属螯合层析和尺寸排阻层析。使用重组技术，特别是用哺乳动物细胞系制造的多肽也可能被病毒污染，包括对健康有害的病原性病毒。如果所述多肽将要施用于个体，则消除任何污染性病毒活性是重要的。当前有许多不同的方法用于灭活病原性病毒，包括例如湿或干热灭活、溶剂/去污剂(S/D)灭活、pH灭活、化学灭活和/或紫外线/γ射线灭活。在这些方法中，S/D灭活可能是使用最广泛的杀病毒方法，因为几乎所有重要的人类病原体都是对溶剂和去污剂的膜破坏敏感的包膜病毒。在S/D灭活方法中，将有机溶剂和去污剂与包括被纯化的多肽的流体混合和孵育。溶剂创造了促进去污剂和包裹病毒的脂质膜之间聚集的环境，而去污剂破坏了在该脂质膜中分子之间的相互作用。一旦被破坏，包膜病毒不再结合并感染细胞，并且无法繁殖，因为完整的脂质膜对于这些活性至关重要。根据世界卫生组织(WHO)指南使用的典型条件是0.3％磷酸三正丁酯(TNBP)和1％聚山梨酯80(PS80，也称为聚氧乙烯(80)脱水山梨醇单油酸酯或80)在24℃孵育最少6个小时，或0.3％TNBP和1％聚氧乙烯辛基苯基醚(X-100)在24℃孵育最少4小时(参见参考文献1)。尽管S/D处理已成为灭活包膜病毒的标准技术，但其应用仍存在一些缺点。在产生最终产品之前，必须基本上去除制造期间添加的S/D混合物。例如，TNBP在所使用的浓度构成健康风险，因此对于制造过程和最终产品而言是一个健康和安全问题。此外，常规使用的去污剂例如X-100构成严重的环境威胁并不得不停用。这种病毒灭活步骤的加入还增加了处理时间，可能使产品产率降低多达10％(参见参考文献2)，并且需要仪器在孵育期间搅动混合物。为了最小化或消除这些问题，已经提出了更简单、更有效的病毒灭活程序。常见的选择涉及使用脂肪酸辛酸(辛酸酯)，例如在参考文献2、3和4中提出的。在参考文献5和6中描述了其他选择。特别地，参考文献6测试了建议在环境上更相容的多种去污剂。使用不同的去污剂对病毒灭活的效果是可变的。而且，尽管特定的去污剂可能能够使病毒灭活，但是不能预测其对进一步纯化方法的影响，例如在DNA或宿主细胞蛋白质减少方面。因此，需要纯化重组表达的多肽的进一步和改善的方法，尤其是实现减少的DNA和蛋白质污染并灭活病原性病毒的方法。
技术实现思路
本专利技术基于向重组多肽中添加烷基糖苷的纯化方法。本专利技术人已经发现，烷基糖苷，特别是正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷，在纯化步骤(例如当在纯化步骤之前添加到进料中时)期间可以提供与过程相关的杂质的改善的清除率。例如，本专利技术人已经发现，与使用诸如TNBP/PS80之类的替代试剂或对照缓冲溶液相比，层析纯化步骤的进料流中存在烷基糖苷可以导致在洗脱液阶段显著更低的宿主细胞DNA和宿主细胞蛋白质水平。而且，烷基糖苷即使在没有任何搅拌而存在短时间时也能够有效的病毒灭活，从而减少了处理时间和成本。所述方法可以在广泛的工艺参数下进行，同时保持这种有效的病毒灭活。除了正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷以外，本专利技术人已经发现正癸基-β-D-吡喃葡萄糖苷、正辛基-β-D-麦芽糖苷，正十二烷基-β-D-麦芽糖苷，正十二烷基-β-D-吡喃葡萄糖苷和正癸基-β-D-麦芽糖苷是用于本专利技术的特别有效的烷基糖苷。因此，本专利技术提供了纯化重组多肽的方法，包括以下步骤：i)提供包含所述重组多肽的溶液；ii)添加烷基糖苷到所述溶液中；和iii)纯化所述重组多肽。所述重组多肽通常将包含在溶液中，所述溶液进一步包含可测量的量的宿主细胞DNA和/或宿主细胞蛋白质。在这些实施方案中，本专利技术提供了分离所述重组多肽与宿主细胞DNA和/或宿主细胞蛋白质的方法，其中步骤(iii)导致这种分离。与没有烷基糖苷的相同方法相比，添加烷基糖苷到溶液中可以改善这种分离，例如将分离改善至少10％(尤其是至少20％)。本专利技术人已经发现，当通过对溶液进行层析的步骤执行步骤(iii)时，能够实现特别有效的分离。层析可以选自任何合适的层析，例如免疫亲和层析、亲和层析、疏水相互作用层析、离子交换层析、多元层析(multimodalchromatography)、尺寸排阻层析或金属螯合层析。在以下进行本专利技术的方式中，本专利技术人特别使用了免疫亲和层析的步骤。疏水相互作用层析和/或离子交换层析也是特别有用的。添加到包含重组多肽的溶液中的烷基糖苷在该溶液中的浓度可以优选地是0.1至1000mM(例如1至500mM、3至400mM、5至200mM、10至100mM、20至90mM)，并且通常是约25至80mM。当通过对溶液进行层析的步骤来执行步骤(iii)时，烷基糖苷可以另外地包含在层析步骤的洗涤缓冲液中。在其他实施方案中，在层析步骤的洗涤缓冲液中包含烷基糖苷可以用作以单独步骤进行步骤(ii)的替代方案。在这些实施方案中，本专利技术因此提供了纯化重组多肽的方法，包括以下步骤：i)提供包含重组多肽的溶液；和iii)通过对溶液进行层析的步骤来纯化所述重组多肽，其中在层析步骤的洗涤缓冲液中包含烷基糖苷。与使用没有烷基糖苷的相应洗涤缓冲液的参考方法相比，通过在层析的洗涤缓冲液中包含烷基糖苷可以进一步降低宿主细胞DNA水平和/或宿主细胞蛋白质(HCP)水平和/或其他蛋白质杂质。可以在方法中包括进一步的纯化步骤，这样的步骤可以在添加烷基糖苷到溶液中的步骤之前或在步骤(iii)之后。纯化步骤通常是层析的步骤。层析可以选自任何合适的层析，例如免疫亲和层析、亲和层析、疏水相互作用层析、离子交换层析、多元层析、尺寸排阻层析或金属螯合层析。例如，方法中可以包括一个或多个疏水相互作用层析步骤。通常，在步骤(iii)之后对溶液进行疏水相互作用层析步骤，特别是当步骤(iii)是免疫亲和层析步骤时。类似地，方法中可以包括一个或多个离子交换层析步骤。通常，在添加烷基糖苷到溶液中的步骤之前，对溶液进行离子交换层析步骤。也可以在步骤(iii)之后对溶液进行离子交换层析步骤，特别是当步骤(iii)是免疫亲和层析步骤时。在该实施方案中，免疫亲和层析步骤之后通常是疏水相互作用层析步骤(如上所述)，其后是离子交换层析步骤。例如，本专利技术人发现，将重组多肽与宿主细胞DNA和/或宿主细胞蛋白质分开的一种特别有效的方法包括以下步骤：a)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.纯化重组多肽的方法，包括以下步骤：i)提供包含所述重组多肽的溶液；ii)添加烷基糖苷到所述溶液中；和iii)通过对所述溶液进行层析的步骤纯化所述重组多肽。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171219 EP 17208630.81.纯化重组多肽的方法，包括以下步骤：i)提供包含所述重组多肽的溶液；ii)添加烷基糖苷到所述溶液中；和iii)通过对所述溶液进行层析的步骤纯化所述重组多肽。


2.权利要求1的方法，其中烷基糖苷另外地包含在层析步骤的洗涤缓冲液中，或者备选地，其中烷基糖苷不添加到步骤ii)中所述的溶液中，而仅包括在层析步骤的洗涤缓冲液中。


3.权利要求1或权利要求2的方法，其中步骤(iii)导致所述重组多肽与溶液中的宿主细胞DNA和/或宿主细胞蛋白质和/或与溶液中的其他蛋白质杂质分离。


4.权利要求3的方法，其中与不添加烷基糖苷到溶液中的相同方法相比，步骤(iii)导致所述重组多肽与溶液中的宿主细胞DNA和/或宿主细胞蛋白质的分离得到改善。


5.前述权利要求中任一项的方法，其中层析是免疫亲和层析、亲和层析、疏水相互作用层析、离子交换层析、多元层析、尺寸排阻层析或金属螯合层析。


6.权利要求5的方法，其中层析是免疫亲和层析。


7.前述权利要求中任一项的方法，其中在添加烷基糖苷到所述溶液中的步骤之前，对溶液进行离子交换层析步骤。


8.前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤(iii)之后，对所述溶液进行疏水相互作用层析步骤。


9.前述权利要求中任一项的方法，其中在步骤(iii)之后，对所述溶液进行多元层析步骤。


10.权利要求8或权利要求9的方法，其中在疏水相互作用或多元层析步骤之后，对所述溶液进行离子交换层析步骤。


11.前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法用于分离所述重组多肽与宿主细胞DNA和/或宿主细胞蛋白质，并且包括以下步骤：a)提供包含重组多肽的溶液；b)通过对溶液进行离子交换层析的步骤纯化所述重组多肽；c)添加烷基糖苷到所述溶液中；d)通过对溶液进行免疫亲和层析的步骤纯化所述重组多肽；e)通过对溶液进行疏水相互作用或多元层析的步骤纯化所述重组多肽；和f)通过对所述溶液进行离子交换层析的进一步步骤纯化所述重组多肽。


12.权利要求5、7、10和11中任一项的方法，其中离子交换层析是阴离子交换层析。


13.前述权利要求中任一项的方法，其中所述方法提供了包含宿主细胞DNA污染的水平小于5000pg/ml的溶液；和/或其中所述方法提供了与除了不使用烷基糖苷或除了使用常规S/D处理例如TNBP/PS80以外与所述方法相同的参考方法相比，包含的宿主细胞DNA污染的水平减少至少1.5、优选地至少2、至少5、至少10、至少20、至少50、至少100、至少150或至少200倍的重组多肽溶液。


14.前述权利要求中任一项的方法，其中所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·勃兰特，H·梅茨纳，C·霍恩，T·诺瓦克，
申请(专利权)人：康诺贝林伦瑙有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH