一种治疗Usher综合征的方法和其组合物技术

本申请涉及一种基于LEAPER技术靶向编辑USH2A基因转录本中含有G到A突变的靶标RNA的方法，包括将用于编辑靶标RNA的腺苷脱氨酶招募RNA(arRNA)或编码所述arRNA的构建体导入所述细胞中，其中所述arRNA包含与所述靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中所述arRNA能够招募作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)以使靶标RNA中的靶标腺苷脱氨基，安全有效地进行RNA上由A到I碱基的体内编辑，修复致病的突变位点，实现治疗疾病例如Usher综合征的目的。疗疾病例如Usher综合征的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种治疗Usher综合征的方法和其组合物


[0001]本申请属于基因编辑治疗领域，具体地，涉及一种基于LEAPER (Leveraging Endogenous ADAR for Programmable Editing on RNA)技术靶向编辑Usher综合征Ⅱ型(Usher Syndrome TypeⅡ)相关基因突变的方法。

技术介绍

[0002]Usher综合征，又称遗传性耳聋
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色素性视网膜炎综合征，是1914年由 Charles Howard Usher描述并命名的
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，是一种由基因突变引起、导致病患先天或逐渐丧失视觉和听觉能力的常染色体隐性遗传性罕见病。Usher综合征发病率在德国约为1/125008，在挪威中为1/280004，在美国为1/23000，据估计在美国16000盲聋人中，一半以上患有Usher综合征1。全球有数万甚至数十万病人亟待治疗。
[0003]1977年，Davenport等人研究了Usher综合征，并根据其严重程度将其分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型3。其中，Ⅰ型为重度先天性耳聋，10岁左右出现严重视觉障碍，Ⅱ型为中度至重度先天性耳聋，约在10～50岁之间逐渐丧失视力。Ⅲ、Ⅳ型相对罕见，并且病情较轻，听觉表现为进行性感音神经性聋，而视觉丧失时间不确定。由于Ⅰ型发病早，介入窗口较小，而Ⅲ、Ⅳ型相对病情较轻。Ⅱ型病人的视觉丧失会从10～20岁起逐渐开始，发病初期为夜盲症，并最终丧失视力(图1)，这使得我们有较长的治疗介入窗口，并有希望终止病人视力的逐渐丧失。
[0004]Neuhaus等人2017年通过高通量测序对138例Usher综合征病人进行了研究，其结果显示在这138例中有82例为USH2A基因突变，而这82例中，又有80例为Usher综合征Ⅱ型(图2)7。由此，当只考虑Usher综合征Ⅱ型病人时，USH2A基因突变的占比超过了90％(图2)7，而针对USH2A基因的治疗方案，很有可能使得这些病人受益。
[0005]USH2A基因编码一种被称为Usherin的蛋白，该蛋白在视觉中发挥了重要的功能，主要是在感光的视锥细胞和视杆细胞中，起到连接内节(InnerSegment)与外节(Outer Segment)的重要作用。当USH2A突变后，会导致视锥细胞和视杆细胞的退行性死亡5。Neuhaus等人2017年的研究表明，在其测序的USH2A基因突变案例中，有13％为NM_206933.2(USH2A)_c.11864G>A (p.Trp3955Ter)，而这一种突变类型为所有突变类型中占比最多的单一突变类型(图3)7。
[0006]由于USH2A基因突变而失去Usherin正常功能是导致USHER综合征Ⅱ型的重要原因，针对USH2A基因的治疗成为了目前Usher II型治疗的主要研发方向。
[0007]目前通过基因疗法治疗USHER综合征Ⅱ型的研发方向主要有两个，一是通过病毒等方式，介导完整的USH2A基因在眼部重新表达。但是，USH2A 基因的蛋白序列非常长，大于6000个氨基酸，这使得其对应的编码区序列大于18000个碱基对。而通常的病毒载体的递送长度有限。通常情况下，慢病毒递送不超过10000个碱基对，而腺相关病毒递送不超过4500个碱基对。这使得通过病毒载体递送全长USH2A基因较难实现。因此，医疗和科研工作者们只能选择递送截短的USH2A基因。这样的方式，虽然可以一定程度缓解病情的恶化，但由于患者依然缺乏正常的全长Usherin，其无法完全实现Usherin原有的正常生理功能。
[0008]另外一种常见的针对USH2A基因的治疗研发方向是通过外显子跨越 (Exon Skipping)实现。由于一部分USH2A基因的突变方式是某个外显子的移码(Frame Shift)或者无义突变(Nonsense Mutation)导致的，因此只要能在 RNA剪接的过程中，特异性地跳过该外显子，就能使得该外显子之后的序列正常翻译。常见的做法，是导入一小段反义核苷酸(Anti
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Sense Oligo, ASO)，从而在剪接过程中特异性地跳过所述翻译核苷酸靶向的外显子。这种方法与上一种方法类似，由于跳过了出现突变的外显子，最终仍然不能得到全长的Usherin。
[0009]近年来，以CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)为首的基因组编辑技术正在飞速发展，并对生物以及医学诸多领域产生了深远的影响。许多科研工作者和生物技术公司也在致力于将该技术推上临床。2019年9月，北京大学邓宏魁教授与其合作者发表文章
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次报道了利用CRISPR技术编辑干细胞并将其回输至患者，以治疗其艾滋病和白血病的临床试验结果，为CRISPR技术在基因治疗方向的转化做出了巨大的贡献。
[0010]尽管CRISPR技术存在极大的应用前景，但该技术也存在一系列缺陷，导致该技术从科研阶段向临床治疗应用的转化步履维艰。问题之一便是 CRISPR技术用到的核心作用酶：Cas9。基于CRISPR的DNA编辑技术，必须外源表达Cas9或拥有相似功能的其它核酸酶，从而造成了以下几个问题。首先，需要外源表达的核酸酶通常具有较大的分子量，这使得通过病毒载体将其递送至体内的效率急剧下降。其次，由于核酸酶的外源表达，使这种方法存在潜在的核酸酶脱靶可能，这将导致其应用中的潜在致癌风险。最后，外源表达的Cas9等类似核酸酶是从细菌中发现的，而非人类或哺乳动物天然存在的，这使其可能引起患者体内的免疫反应，这一方面可能会对患者自身造成损伤，另一方面也可能会使外源表达的核酸酶被中和，从而失去应有的活性，影响治疗效果。
[0011]2017年，麻省理工学院张锋教授及其课题组报道了一种名为REPAIR (RNA Editing for Programmable A to I Replacement)的RNA编辑技术，通过外源表达Cas13
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ADAR融合蛋白及单向导RNA(single guide RNA,sgRNA)可以实现靶向目标RNA的A到I的编辑，但是该方法同CRISPR技术一样，仍需要外源蛋白的表达。无法解决外源蛋白表达造成的问题。
[0012]2019年1月，Thorsten Stafforst课题组报道了名为RESTORE(recruitingendogenous ADAR to specific trans for oligonucleotide
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mediated RNA editing, Merkle et al.,2019)的RNA单碱基编辑技术。RESTORE能够摆脱对外源蛋白的依赖，但RESTORE技术需要在IFN
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γ存在的前提下才能有较高的编辑效率，而IFN
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γ是决定自体免疫发展和严重程度的关键因子，这使得该技术在医学领域的应用大打折扣。另一本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于LEAPER技术靶向编辑细胞中靶标RNA的方法，其中所述靶标RNA为USH2A基因转录本中含有G到A突变的RNA，该方法包括：将包含用于编辑靶标RNA的腺苷脱氨酶招募RNA(arRNA)的构建体或编码所述arRNA的构建体导入所述细胞中，其中所述arRNA包含与所述靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中所述arRNA能够招募作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)以使靶标RNA中的靶标腺苷脱氨基。2.如权利要求1中所述的方法，其中所述靶标RNA为mRNA前体(Pre
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mRNA)。3.如权利要求1或2中所述的方法，其中所述arRNA长约151
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61nt、131
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66nt、121
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66nt、111
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66nt、91
‑
66nt或81
‑
66nt。4.如权利要求3中所述的方法，其中所述arRNA长度选自66nt
‑
131nt中的任意自然数。5.如权利要求1
‑
4中任一项所述的方法，其中所述arRNA中靶向碱基距离3
’
端的长度≥7nt，≥10nt、≥15nt，优选16
‑
55nt、20
...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘能银，易泽轩，袁鹏飞，赵艳霞，汤刚斌，
申请(专利权)人：博雅辑因北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：