一种标准品载体及其在测定重组腺相关病毒滴度中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于测定重组腺相关病毒滴度的标准品载体，所述标准品载体含有常用BGHpA和SV40pA元件，且两个ITR外侧分别具有一个MlyI酶切位点，能酶切产生ITR平末端，当用MlyI酶切标准品载体骨架后，回收的线性化rAAV标准品片段中仅包含转基因表达框及两侧ITR序列，该标准品不包含任何的骨架序列，在最大程度上模拟了野生型AAV病毒的ITR结构，保证了rAAV病毒滴度测定的准确性，具有高效、准确、重复性好的特点，克服了现阶段AAV标准品制备不合格引起的qPCR检测结果不准确的问题。合格引起的qPCR检测结果不准确的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种标准品载体及其在测定重组腺相关病毒滴度中的应用


[0001]本专利技术属于慢病毒病毒滴度检测
，具体涉及一种标准品载体及其在测定重组腺相关病毒滴度中的应用。

技术介绍

[0002]重组腺相关病毒(recombinant adeno
‑
associated virus,rAAV)因其非整合、无致病性、携带的治疗基因表达时间长、靶向性好等特点被广泛应用于基础研究和临床基因治疗中。目前，针对不同疾病已进行了接近200例rAAV临床试验，且有许多研究性新药正处于FDA和EMA的不同审查阶段，首个基于rAAV的基因治疗药物Glybera已于2012年被欧盟批准用于治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症(LPLD)。尽管rAAV的临床试验已证明其良好的疗效及高度的安全性，但rAAV剂量缺乏统一有效的标准化测定方法仍然是阻碍其商业化的限制因素。因此，建立合适的质量控制方法以精确测定rAAV的准确剂量显得至关重要。
[0003]病毒滴度(vg/ml)是rAAV临床治疗中衡量rAAV病毒剂量的重要指标。目前应用最广泛的rAAV病毒滴度测定方法是实时荧光定量PCR(Quantitative Real
‑
time PCR,qPCR)。qPCR法是在PCR体系中加入荧光基团以实时监测扩增过程中荧光信号的变化，然后通过标准曲线对待测样品进行定量，主要包括SYBR Green I法和TaqMan探针法。与TaqMan探针法相比，SYBR Green I法不需要探针，成本低廉，因此更适用于大规模的rAAV病毒滴度测定中，本专利技术即采用SYBR Green I法对rAAV进行病毒滴度测定。SYBR Green I法使用SYBR Green I染料作为荧光标记物，它能特异性地结合双链DNA并发射荧光信号，通过已知浓度的标准品制定出标准曲线，从而换算出待测rAAV病毒基因组的拷贝数。该方法具有灵敏度高、特异性强、简便快捷等特点，只需2～3个小时即可得到结果。
[0004]准确定量rAAV病毒滴度是实现精确给药剂量和保障患者安全的前提条件。基于SYBR Green I的qPCR检测方法的准确性取决于能否得到精确的标准曲线，其中合格标准品的制备显得尤为关键。rAAV基因组包括上下游145nt的反向末端重复序列(Inverted Terminal Repeat,ITR)及两者之间的转基因表达盒。目前，研究者们主要采用两种策略来测定rAAV滴度，一种是针对特定的转基因序列或者polyA序列来设计qPCR引物，但由于不同AAV载体中转基因及polyA序列的可变性，因此该方法并不是一种通用的rAAV滴度测定方法。另外一种是将上下游qPCR引物设计在rAAV载体的ITR上，由于大部分研究者采用酶切线性化的方法，将两个ITR以及两者之间的转基因表达盒连同部分骨架序列回收作为标准品，导致同一样品的滴度测定出现了实验室间及实验室内的偏差。

技术实现思路

[0005]本专利技术的第一个目的在于提供一种标准品载体。
[0006]本专利技术的第二个目的在于提供一种标准品。
[0007]本专利技术的第三个目的在于提供上述标准品载体的构建方法。
[0008]本专利技术的第四个目的在于提供一种试剂盒。
[0009]本专利技术的第五个目的在于提供一种测定重组腺相关病毒滴度的方法。
[0010]本专利技术的第六个目的在于提供上述标准品载体或标准品或试剂盒在测定重组腺相关病毒滴度中的应用。
[0011]本专利技术所采取的技术方案是：
[0012]本专利技术的第一个方面，提供一种重组腺相关病毒的标准品载体，含有第一ITR和第二ITR，所述第一ITR位于第二ITR的上游，所述第一ITR的上游和第二ITR的下游分别具有一个Type IIS限制性内切酶的酶切位点。
[0013]进一步地，所述酶切位点能酶切产生AAV2野生型ITR平末端。
[0014]优选地，所述Type IIS限制性内切酶的为MlyI酶。
[0015]进一步地，所述MlyI酶的酶切位点的序列为：
[0016]5’‑
GAGTCNNNNN
‑3’
(SEQ ID NO.1)；
[0017]3’‑
CTCAGNNNNN
‑5’
(SEQ ID NO.2)。
[0018]Type IIS限制性内切酶MlyI是一组比较特殊的内切酶，其识别位点与切割位点不同，且切割位点位于识别位点另一侧。利用Type IIS限制性内切酶的这个特点，我们在用于制备rAAV标准品的骨架载体的两个ITR外侧分别添加了一个能酶切产生ITR平末端的MlyI酶切位点。
[0019]本专利技术的第二个方面，提供一种标准品，所述标准品含有本专利技术第一方面所述标准品载体。当用MlyI酶切标准品载体骨架后，回收的线性化rAAV标准品片段中仅包含转基因表达框及两侧ITR序列，该标准品不包含任何的骨架序列，因此在最大程度上模拟了野生型AAV病毒的ITR结构，保证了rAAV病毒滴度测定的准确性，具有高效、准确、重复性好的特点。
[0020]本专利技术的第三个方面，提供上述标准品载体的构建方法，包含以下步骤：
[0021]S1：以质粒为骨架，将MlyI酶切位点克隆到5
’
ITR前面；
[0022]S2：将MlyI酶切位点克隆到质粒的3
’
ITR后面。
[0023]进一步地，所述MlyI酶切位点的序列为：
[0024]5’‑
GAGTCNNNNN
‑3’
(SEQ ID NO.1)；
[0025]3’‑
CTCAGNNNNN
‑5’
(SEQ ID NO.2)。
[0026]进一步地，所述质粒为报告质粒。
[0027]进一步地，所述报告质粒中的报告基因替换为BGH pA。
[0028]优选地，所述质粒为pAAV[Exp]‑
EFS>EGFP
‑
SV40pA。
[0029]进一步地，所述EGFP替换为BGH pA，也可以是其他能起到终止转录的终止子。
[0030]进一步地，将EGFP替换为BGH pA可增加载体的通用性。
[0031]本专利技术的第四个方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒含有上述标准品载体或标准品。
[0032]本专利技术的第五个方面，提供一种重组腺相关病毒滴度检测的方法，包含以下步骤：
[0033]1.在重组腺相关病毒的标准品的载体中添加本专利技术第一方面所述的酶切位点进行酶切处理；
[0034]2.检测重组腺相关病毒的滴度。
[0035]根据本专利技术的第五个方面，所述重组腺相关病毒的标准品的载体中包含报告基
因，将报告基因替换为BGH pA，进一步增加载体通用性。
[0036]根据本专利技术的第五个方面，所述检测为通过实时荧光定量PCR进行重组腺相关病毒的滴定检测。
[0037]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组腺相关病毒的标准品载体，含有第一ITR和第二ITR，所述第一ITR位于第二ITR的上游，其特征在于，所述第一ITR的上游和第二ITR的下游分别具有一个Type IIS限制性内切酶的酶切位点。2.根据权利要求1所述的标准品载体，其特征在于，所述酶切位点能酶切产生AAV2野生型ITR平末端。3.根据权利要求1所述的所述标准品载体，其特征在于，所述Type IIS限制性内切酶为MlyI酶。4.根据权利要求3所述的标准品载体，其特征在于，所述酶切位点的序列为：5
’‑
GAGTCNNNNN
‑3’
(SEQ ID NO.1)；3
’‑
CTCAGNNNNN
‑5’
...

【专利技术属性】
技术研发人员：施金秀，罗燕，陈艺彬，林映君，叶知晟，
申请(专利权)人：云舟生物科技广州有限公司，
类型：发明
国别省市：