一种筛选调控序列的载体体系和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种文库高度多样性的文库构建方法，摒弃了蛋白改组中所采用的体外同源重组技术，通过引入Y型adaptor与DNaseI消化后小于100bp的随机片段连接，成功解决了具有相似特性的或具有特定或未知功能的功能元件无法进行有效重组的缺陷，该方法主要涉及三种文库的构建，分别为构建标签文库、功能元件文库以及索引标签文库，能够快速高通量实现功能元件多样性的构建方法，为最终筛选得到具有优良性能的功能元件奠定了坚实的基础。性能的功能元件奠定了坚实的基础。

【技术实现步骤摘要】
一种筛选调控序列的载体体系和应用
[0001]本申请是申请日为2020.12.31、专利技术名称为“一种功能元件的建库方法及其应用”、申请号为202011630533.X的专利技术的分案申请。


[0002]本专利技术属于生物工程领域，更具体地，涉及一种筛选调控序列的载体体系和应用。

技术介绍

[0003]基因的表达离不开调控序列的作用，启动子或增强子作为调控序列之一，是一段位于结构基因5
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上游上下游区域的DNA序列，能够准确地与特定的RNA聚合酶及相关转录因子结合，从而启动下游基因的转录起始，是调控基因表达最重要的顺式作用元件。真核生物启动子包含三种具有重要生物功能的保守序列，分别为位于
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35～
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25区的TATA盒(TATA box)、位于
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80～
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70区的CAAT盒(CAAT box)和位于
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110～
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80区的GC盒(GC box)。其中TATA盒参与调控下游基因的精确转录起始，CAAT盒和GC盒参与调控转录起始的频率。尽管上述三种功能区域是构成启动子功能活性的重要体现，但并不是每个启动子都包含这三种功能区域，这三个功能区域的任意碱基或相对位置的改变往往会造成启动子活性及特异性的剧烈变化。上游启动子或增强子活性以及基因附近的调控序列如5
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UTR和3
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UTR是决定下游基因能否顺利表达及表达水平是否适中的关键性因素，因此，为了使目的基因获得更好的表达，在体外利用分子定向进化技术对启动子调控序列进行改造筛选便显得尤为重要。
[0004]自然进化是一个漫长的优胜劣汰、有利突变不断积累的过程，为了加快这一进程，研究人员在体外模拟突变、重组和选择的自然进化机制，使进化朝着预期的方向发展。早期研究人员主要采用物理方法、化学方法、致突变菌株或易错PCR等方法将随机突变引入到蛋白质编码基因中，然后进行细胞或动物水平的功能筛选，从而得到能够满足人们需要的新功能或优良性能的蛋白质。这些方法虽然能够在一定程度上改善蛋白的某些特性，但是其所具备的多样性远远无法满足人们的需求。随着分子生物学的不断发展，人们建立了一种基于PCR技术的新的体外定向分子进化技术
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DNA改组(DNA shuffling)技术，该技术由Stemmer于1994年首次提出，可用于核酸、蛋白的体外定向进化。DNA改组涉及将不同来源的多个相关基因家族通过DNaseI消化或超声破碎成随机片段，然后利用各片段间的同源性互为模板和引物，经过无引物PCR(primerless PCR)将这些片段重新组装成全长基因，该过程会所产生模板切换或交叉事件，从而增加了突变体文库的多样性。然后利用针对不同蛋白编码框的特异性5
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端和3
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端引物对蛋白突变体进行扩增，并克隆到相关的克隆载体上形成突变体文库，通过NGS测序验证文库多样性(～106以上)，最后在细胞水平或动物水平进行功能筛选，得到一种具有改良特性的蛋白。该方法主要针对蛋白分子的定向进化，作为起始模板的不同基因之间需要具备一定的同源性，从而产生小片段间的体外同源重组引入突变形成可供筛选的突变体文库。
[0005]启动子或增强子DNA改组(promoter or enhancer shuffling)的主要目的是增强启动子的活性或特异性改变基因的表达特性，具有相似特性的启动子调控序列(如特异性
靶向相同的组织或器官)之间往往同源性极低，因此上述针对蛋白分子的DNA改组技术显然并不能够生搬硬套用于启动子调控序列的定向进化。目前，启动子改组一般采用以下技术路线：(1)对单个启动子进行两轮易错PCR，回收PCR产物(形成大量具有同源序列的突变体)；(2)用DNaseI消化或超声破碎成随机片段并回收；(3)将回收产物作为模板，进行无引物PCR；(4)在无引物PCR体系中加入含有特定酶切位点的特异性引物扩增全长启动子，回收特定大小的PCR产物；(5)用对应的限制性内切酶对克隆载体及全长启动子突变体进行酶切连接；(6)NGS测序验证启动子文库的多样性。该技术路线高度重复了蛋白定向进化的方法，且仅能对单个启动子来源进行改组，即便第一轮的易错PCR提高了模板的多样性，其本质上仍来源于同一个启动子，因此该启动子文库的多样性仍受到极大的限制，相同体系下一般只能到达104～105，筛选有特定功能的调控序列难度较大。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种筛选调控序列的载体体系和应用。
[0007]本专利技术的目的在于克服启动子改组方法的局限性，解决不同来源启动子由于同源性低而无法进行高效的体外重组导致文库多样性不足的问题，提供一种功能元件文库的构建方法
[0008]本专利技术所采取的技术方案是：
[0009]本专利技术的第一个方面，提供一种质粒载体，其包括：索引标签、报告基因和条码标签；
[0010]所述条码标签为长度为5～200bp的随机片段；
[0011]所述索引标签的个数至少为1，index1和index2独立的选自长度为5～100bp的随机片段；
[0012]所述报告基因的表达产物为可通过催化底物反应自身发光或产生颜色变化、可通过催化底物反应使底物发光或产生颜色变化、或经过激发光照射而产生发射光或产生颜色变化、或可抵抗相应药物筛选。
[0013]一些实施例中，所述条码标签为长度为40bp的随机片段；所述索引标签的数量为2，其中index1为长度为30bp的随机片段，index2为长度为30bp的随机片段，所述报告基因选自荧光蛋白、荧光素酶、LacZ基因或能起到筛选作用的抗性基因中的至少一种，所述抗性基因包括嘌呤霉素抗性基因。
[0014]一些具体实施例中，所述质粒载体依次包括如下元件：pUC ori、5
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ITR、BGH pA、index1、AsiSI酶切位点、index2、Kozak、TurboGFP基因、条码标签、WPRE、BGH pA、3
’
ITR和Amp抗性筛选标记；其中，条码标签为长度为40bp的随机片段，所述index1为长度为30bp的随机片段，所述index2为长度为30bp的随机片段；
[0015]另一些具体实施例中，所述质粒载体依次包括如下元件：pUC ori、5
’
ITR、BGH pA、index1、AsiSI酶切位点、随机重组调控序列、AsiSI酶切位点、index2、Kozak、TurboGFP基因、条码标签、WPRE、BGH pA、3
’
ITR和Amp抗性筛选标记；其中，随机重组调控序列的长度为50～2000bp，为经DnaseI酶消化后的启动子片段或酶消化后的增强子片段，条码标签为长度为40bp的随机片段，所述index1为长度为30bp的随机片段，所述index2为长度为30bp的
随机片段。
[0016]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.质粒载体，其包括：索引标签、报告基因和条码标签；所述条码标签为长度为5～200bp的随机片段；所述索引标签的个数至少为1，其独立的选自长度为5～100bp的随机片段；所述报告基因的表达产物为可通过催化底物反应自身发光或产生颜色变化、可通过催化底物反应使底物发光或产生颜色变化、或经过激发光照射而产生发射光或产生颜色变化、或可抵抗相应药物筛选。2.根据权利要求1所述的质粒载体，其特征在于，所述条码标签为长度为40bp的随机片段；所述索引标签的数量为2，其中index1为长度为30bp的随机片段，index2为长度为30bp的随机片段，所述报告基因选自荧光蛋白、荧光素酶、LacZ基因或能起到筛选作用的抗性基因中的至少一种，所述抗性基因包括嘌呤霉素抗性基因。3.根据权利要求2所述的质粒载体，其特征在于，依次包括如下元件：pUC ori、5
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ITR、BGH pA、index1、index2、报告基因、条码标签、WPRE、BGH pA、3
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ITR和抗性筛选标记。4.根据权利要求3所述的质粒载体，其特征在于，所述index1和index2之间还包括酶切位点和随机重组调控序列。5.根据权利要求4所述的质粒载体，其特征在于，所述酶切位点为AsiSI；所述酶切位点的数量为2，位于所述随机重组调控序列的两端；所述随机重组调控序列为经酶消化后的启动子片段或酶消化后的增强子片段。6.根据权利要求5所述的质粒载体，其特征在于，所述酶消化的酶为DnaseI；所述启动子选自hRO、hRK、mCAR或ProA1；所述增强子选自CMV_en、HBB_en或SV40_en。7.根据权利要求1～6任一项所述的质粒载体，其特征在于，依次包括如下元件：pUC ori、5
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ITR、BGH pA、index1、AsiSI酶切位点、index2、Kozak、TurboGFP基因、条码标签、WPRE、BGH pA、3
’
ITR和Amp抗性筛选标记；其中，条码标签为长度为40bp的随机片段，所述index1为长度为30bp的随机片段，所述index2为长度为30bp的随机片段；或者依次包括如下元件：pUC ori、5
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ITR、BGH pA、index1、A...

【专利技术属性】
技术研发人员：施金秀，罗燕，肖晓丹，叶知晟，
申请(专利权)人：云舟生物科技广州有限公司，
类型：发明
国别省市：