一种用于生产腺病毒的293A细胞株及其制备与应用制造技术

本发明专利技术涉及细胞工程技术领域，尤其涉及一种用于生产腺病毒的293A细胞株及其制备与应用。本发明专利技术的细胞为在293A细胞基因组中Ad5基因的位置插入一段包含LoxM2、HPRT intron和Hygro cassette的外源片段得到。利用本发明专利技术的细胞产生的复制性腺病毒基因组由于基因组超过腺病毒粒子的包装极限，无法形成完整的腺病毒粒子，从而可解决腺病毒生产过程中RCA和HDEP污染的问题。HDEP污染的问题。HDEP污染的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种用于生产腺病毒的293A细胞株及其制备与应用


[0001]本专利技术涉及细胞工程
，尤其涉及一种用于生产腺病毒的293A细胞株及其制备与应用。

技术介绍

[0002]复制缺陷型腺病毒在基因药物、疫苗制备、溶瘤腺病毒等方面有着广泛的应用。
[0003]目前使用的复制缺陷型腺病毒多为缺失了E1区和E3区的血清型5型腺病毒。由于E1区为腺病毒复制的必需区域，所以复制缺陷型腺病毒必需在含有E1区的补充细胞系中进行增值。使用最广的复制缺陷型腺病毒包装细胞是293细胞，包含Ad5基因组中1～4344bp序列，包括5
’
端反向重复序列(ITR)、包装信号、E1a、E1b基因和pIX编码序列。但复制缺陷型腺病毒与293细胞中腺病毒基因组片段有重叠区域，在细胞内发生同源重组时，可使复制缺陷型腺病毒重新获得E1区而成为复制性腺病毒(Replication
‑
competent adenoviruses，RCA)。RCA出现的概率随着传代次数的增加而逐渐增大。RCA是复制缺陷型腺病毒扩增过程中的污染物，用于人体时存在潜在的安全问题，所以用于临床的复制缺陷型腺病毒药物必需进行RCA检测。
[0004]解决这个问题的方法主要有载体构建和改造细胞系两个方向：(1)构建腺病毒载体时增加缺失区域，如缺失多个复制必需的区域，如E2区和/或E4区。缺失多个片段的复制缺陷型腺病毒需进行多次重组才能重新获得复制能力，从而降低RCA出现的概率和增加载体的容量，但随着缺失区域的增多，构建用于复制的稳定细胞系的难度增大，且病毒滴度可能随着缺失区域的增大而降低；(2)改造细胞系，即缺失293细胞系中Ad5 DNA序列与腺病毒载体的同源区域，尽可能地减少同源序列，减少或消除RCA，如目前广泛应用于腺病毒包装的细胞系PER.C6，虽然通过极大的减少细胞基因组和腺病毒载体之间的同源部分，从而达到防止RCA产生的效果。但是与PER.C6细胞匹配使用的载体和PER.C6细胞仍然存在177bp的同源部分，通过概率极低的非常规同源重组，产生辅助病毒依赖性含E1颗粒(helper
‑
dependent E1 containing particle，HDEP)。HDEP含有E1区，在腺病毒载体或是野生型腺病毒存在的情况下，可能产生具有复制能力的重组腺病毒产物，有潜在的风险。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于生产腺病毒的293A细胞株及其制备与应用，可解决腺病毒生产过程中RCA和HDEP污染的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：提供一种细胞，所述细胞为在293A细胞基因组中Ad5基因(Ad5病毒的NCBI号：AY339865.1)的位置插入一段包含LoxM2、HPRT intron和Hygro cassette的外源片段得到。其中，LoxM2在Cre酶的存在下，可靶向插入其他基因，为细胞株的进一步改造提供便利。HPRT intron是人基因的内含子，也可用其他合适的内含子代替。Hygro cassette是为了在细胞构建过程中提供筛选标记。
[0007]本专利技术的细胞产生的复制性腺病毒基因组由于基因组超过腺病毒粒子的包装极
限，无法形成完整的腺病毒粒子，从而解决腺病毒生产过程中RCA和HDEP污染的问题。
[0008]作为本专利技术所述细胞的优选实施方式，所述LoxM2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述HPRT intron的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述Hygro cassette的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0009]作为本专利技术所述细胞的优选实施方式，所述外源片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0010]作为本专利技术所述细胞的优选实施方式，所述插入的位点为Ad5基因的3522bp的位置。本专利技术选择该插入位点，是因为此位置位于Ad5 E1B基因的内含子处，插入外源基因不会影响基因的正常表达，但如果发生重组，外源片段将被包含于病毒基因组中从而使基因组超过包装限度而无法形成完整粒子。
[0011]本专利技术还提供所述细胞的构建方法，所述构建方法为在293A细胞基因组中Ad5基因的位置插入一段包含LoxM2、HPRT intron和Hygro cassette的外源片段。
[0012]作为本专利技术所述构建方法的优选实施方式，所述构建方法为利用非同源依赖的靶向整合法，用CRISPR/Cas9系统使293A细胞的基因组和携带所述外源片段的质粒均形成DNA双链断裂，利用非同源末端连接的DNA修复途径，将线性化的外源片段插入到细胞基因组的靶向位点，从而形成靶向整合。
[0013]非同源依赖的靶向整合法(homologyindependent targeted integration，or HITI)用CRISPR/Cas9系统使基因组和携带外源片段的质粒均形成DSB(double strand break)，利用非同源末端链接(Non
‑
homologous end joining，NHEJ)的DNA修复途径，将线性化的外源片段插入到细胞基因组的靶向位点，从而形成靶向整合。该方法在介导外源片段定点插入细胞基因组时，跟依赖于末端同源重组的HDR(the homology
‑
directed repair)相比，能够同时编辑分裂细胞和非分裂细胞，且编辑的效率更高、插入和缺失的概率更低，是一种具有广阔应用前景的方法。而目前用于构建此类细胞系的方法多是根据HDR同源重组将片段插入细胞中，但这种靶向插入的方法是低效的。
[0014]用HITI的方法构建一株在生产复制缺陷型腺病毒载体的过程中不产生RCA和HDEP的293A细胞株，将其命名为VB
‑
293A。该细胞株在293A的Ad5基因组的3522bp的位置插入一段包含LoxM2、HPRT intron和Hygro cassette的约9Kb的外源片段。当同源重组发生时，产生的复制性腺病毒基因组由于基因组超过腺病毒粒子的包装极限，无法形成完整的腺病毒粒子，从而解决腺病毒生产过程中RCA和HDEP污染的问题。
[0015]作为本专利技术所述构建方法的优选实施方式，所述携带外源片段的质粒为pDown
‑
HBV ployA
‑
HPRT intron
‑
mPGK
‑
Hygro
‑
SV40 pA
‑
gRNA2。
[0016]本专利技术提供一种使用所述细胞包装腺病毒的方法，所述方法为用缺失E1基因的腺病毒感染所述细胞。
[0017]本专利技术还提供所述细胞在制备腺病毒中的应用。
[0018]本专利技术的有益效果：
[0019]本专利技术的用于生产无RCA腺病毒的293A细胞株，此细胞株由于在E1b内含子区域插入约9Kb的外源片段，当缺陷型腺病毒载本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞，其特征在于，所述细胞为在293A细胞基因组中Ad5基因的位置插入一段包含LoxM2、HPRT intron和Hygro cassette的外源片段得到。2.根据权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述LoxM2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述HPRT intron的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述Hygro cassette的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。3.根据权利要求2所述的细胞，其特征在于，所述外源片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。4.根据权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述插入的位点为Ad5基因的3522bp的位置。5.权利要求1
‑
4任一所述细胞的构建方法，其特征在于，所述构建方法为在293A细胞基因组中Ad5基因的位置插入一段包含LoxM2、HPRT intron和Hygro cassette的外源片段。6.根据权利要求5所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：施金秀，陈咏，罗燕，蒙伟能，蓝田，
申请(专利权)人：云舟生物科技广州有限公司，
类型：发明
国别省市：