自身免疫性脑炎抗体瞬转与稳转检测方法及其应用技术

本发明专利技术提供了自身免疫性脑炎抗体瞬转与稳转检测方法及其应用。具体地，本发明专利技术提供了一种表达突变型NMDAR的重组细胞，所述重组细胞表达外源的突变型NMDAR和荧光蛋白的融合蛋白，且转染成活率高。本发明专利技术的重组细胞可用于检测自身免疫性脑炎相关的抗体，包括NMDAR、AMPAR1、AMPAR2、LGI1、Caspr2、GABA

【技术实现步骤摘要】
自身免疫性脑炎抗体瞬转与稳转检测方法及其应用


[0001]本专利技术涉及医学领域，具体地涉及自身免疫性脑炎抗体瞬转与稳转检测方法及其应用。

技术介绍

[0002]自身免疫性脑炎(Autoimmune encephalitis,AE)是近10余年来新进被认识的一类中枢神经系统自身免疫性疾病，其特点是患者体内存在抗神经元表面蛋白、离子通道和受体的自身抗体，这些自身抗体被认为具有致病性，可以成为疾病诊断的标志物。AE患者常表现出精神行为异常、癫痫发作、记忆障碍、认知异常、运动异常、自主神经功能紊乱、意识下降等严重的临床症状，但早期的免疫治疗可取得很好的疗效与疾病转归。一般而言，常见的介导AE的特异性自身抗体有NMDAR、AMPAR1、AMPAR2、LGI1、Caspr2、GABA
B
R六种，并且不同抗体介导的AE患者与伴发肿瘤及预后均有较大差异。因此，及时准确检测相关自身抗体对AE早期诊治具有极其重要的意义。
[0003]2005年，在4例年轻女性卵巢畸胎瘤患者中首次发现了记忆缺失、精神症状、意识水平下降及通气不足的一组症状
[1]。很快在这些患者以及其他几例类似神经系统症状的患者中检测出一种N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR)的特异性抗体。此后，陆续报道的病例中有很多是儿童或青年男性患者，可伴或不伴肿瘤。此病被命名为抗NMDAR脑炎(Anti-NMDAR encephalitis)。
[0004]研究表明，自身免疫性脑炎抗体是造成自身免疫性脑炎的病因之一，然而，本领域尚缺乏敏感性和特异性均高的AE自身抗体的检测方法。
[0005]虽然尝试开发基于AE自身抗体-NMDAR之间的相互作用来进行检测的方法，但是重组表达和纯化的NMDAR构象与天然状态下的NMDAR构象存在差异，导致灵敏度和特异性较差。
[0006]另一种检测方法是基于活细胞分析(Cell-based Assay,CBA)，一种代表性的方法是间接免疫荧光法。在该方法中，一般通过重组转染细胞系表达NMDAR亚基(NR1和NR2A)，然后通过间接免疫荧光法来检测抗NMDAR抗体，具有一定的敏感性。然而，该方法还存在缺点，例如NMDAR亚基(NR1和NR2A)会导致细胞大量死亡，导致测量不够准确，且重复性差。
[0007]因此，本领域迫切需要开发新的高敏感性和高特异性AE自身抗体的检测方法。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的就是提供一种高敏感性和高特异性的AE自身抗体的检测方法。
[0009]本专利技术的另一目的是提供了一种基于本专利技术的重组的转染细胞系，利用转染细胞系通过间接免疫荧光法来检测抗自身免疫性脑炎方法。
[0010]在本专利技术的第一方面，提供了一种制备重组细胞的方法，所述方法包括步骤：
[0011](a)提供待转染的细胞以及用于转染的第一质粒和第二质粒；其中，所述的细胞为待转染的细胞为肾细胞，
[0012]所述的第一质粒含有第一表达盒，所述第一表达盒用于表达式I所示的融合蛋白P0，
[0013]Z1-Z2
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(I)
[0014]式中，
[0015]Z1为突变型NMDAR亚基NR1，所述突变型NMDAR亚基NR1的序列如SEQ ID No:2所示；
[0016]Z2为GFP蛋白元件；
[0017]所述的第二质粒含有第二表达盒，所述的第二表达盒用于表达NMDAR亚基NR2A；
[0018](b)将所述的第一质粒和第二质粒转入所述的待转染的细胞，从而获得所述的重组细胞C0，其中所述的重组细胞C0表达重组的NMDAR蛋白。
[0019](c)检测步骤(b)所获得的重组细胞的存活情况。
[0020]在另一优选例中，所述的重组的NMDAR蛋白由式I所示的融合蛋白P0和NMDAR亚基NR2A构成。
[0021]在另一优选例中，所述的第一质粒和第二质粒为同一质粒或不同的质粒。
[0022]在另一优选例中，所述方法还包括：
[0023]在另一优选例中，所述的待转染的细胞为人肾细胞。
[0024]在另一优选例中，所述的待转染的细胞为HEK-293细胞。
[0025]在本专利技术的第二方面，提供了一种重组细胞(即重组细胞C0)，所述的重组细胞是用第一方面所述的方法制备的。
[0026]在另一优选例中，所述的重组细胞表达NMDAR突变蛋白，所述NMDAR突变蛋白由NR1亚基和NR2A亚基构成，其中，NR1亚基为突变型亚基，且NR1亚基的第815位氨基酸由野生型的甘氨酸突变为精氨酸。(注：其中所述815位氨基酸位于NMDAR跨膜区M4段)。
[0027]在另一优选例中，所述的NR1亚基以式I所示的融合蛋白形式存在。
[0028]在另一优选例中，所述的重组细胞表达NMDAR突变蛋白，并且所述的NMDAR突变蛋白以膜蛋白形式存在于重组细胞的细胞膜上。
[0029]在另一优选例中，所述的突变型NMDAR突变蛋白以跨膜蛋白形式存在于所述重组细胞的细胞膜上。
[0030]在另一优选例中，所述重组细胞在转染后12-24小时，细胞存活率≥50％，较佳地为50％-85％，更佳地60％-75％。
[0031]在另一优选例中，所述的转染指用所述的第一质粒和第二质粒进行转染。
[0032]在本专利技术的第三方面，提供一种本专利技术第二方面所述的重组细胞或用于制备所述的重组细胞的转染试剂的用途，它被用于制备检测自身免疫性脑炎的检测试剂或试剂盒。
[0033]在另一优选例中，所述的试剂盒含有：(Y0)本专利技术第二方面所述的重组细胞C0,或用于制备所述重组细胞C0的转染试剂。
[0034]在另一优选例中，所述的试剂盒还包括一使用说明书，所述使用说明书描述了检测样本中是否存在抗NMDAR蛋白的抗体的使用方法。
[0035]在另一优选例中，所述的试剂盒，还含有选自下组的额外试剂：
[0036](Y1)用于表达AMPAR1蛋白的重组细胞C1,或用于制备所述重组细胞C1的转染试剂；
[0037](Y2)用于表达AMPAR2蛋白的重组细胞C2，或用于制备所述重组细胞C2的转染试
剂；
[0038](Y3)用于表达LGI1蛋白的重组细胞C3，或用于制备所述重组细胞C3的转染试剂；
[0039](Y4)用于表达Caspr2蛋白的重组细胞C4，或用于制备所述重组细胞C4的转染试剂；
[0040](Y5)用于表达GABA
B
R蛋白的重组细胞C5，或用于制备所述重组细胞C5的转染试剂；
[0041](Y6)所述Y1～Y5的任意组合。
[0042]在另一优选例中，所述的重组细胞C0、C1、C2、C3、C4和C5为同一细胞或不同的细胞。
[0043]在另一优选例中，所述的试剂，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备重组细胞的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：(a)提供待转染的细胞以及用于转染的第一质粒和第二质粒；其中，所述的细胞为待转染的细胞为肾细胞，所述的第一质粒含有第一表达盒，所述第一表达盒用于表达式I所示的融合蛋白P0，Z1-Z2
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(I)式中，Z1为突变型NMDAR亚基NR1，所述突变型NMDAR亚基NR1的序列如SEQ ID No:2所示；Z2为GFP蛋白元件；所述的第二质粒含有第二表达盒，所述的第二表达盒用于表达NMDAR亚基NR2A；(b)将所述的第一质粒和第二质粒转入所述的待转染的细胞，从而获得所述的重组细胞C0，其中所述的重组细胞C0表达重组的NMDAR蛋白；(c)检测步骤(b)所获得的重组细胞的存活情况。2.一种重组细胞，其特征在于，所述的重组细胞是用权利要求1所述的方法制备的。3.如权利要求2所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞表达NMDAR突变蛋白，所述NMDAR突变蛋白由NR1亚基和NR2A亚基构成，其中，NR1亚基为突变型亚基，且NR1亚基的第815位氨基酸由野生型的甘氨酸突变为精氨酸。4.如权利要求2所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞在转染后12-24小时，细胞存活率≥50％，较佳地为50％-85％，更佳地60％-75％。5.一种权利要求2所述的重组细胞或用于制备所述的重组细胞的转染试剂的用途，其特征在于，用于制备检测自身免疫性脑炎的检测试剂或试剂盒。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还含有选自下组的额外试剂：(Y1)用于表达AMPAR1蛋白的重组细胞C1,或用于制备所述重组细胞C1的转染试剂；(Y2)用于表达AMPAR2蛋白的重组细胞C2，或用于制备所述重组细胞C2的转染试剂；(Y3)用于表达LGI1蛋白的重组细胞C3，或用于制备所述重组细胞C3的转染试剂；(Y4)用于表达C...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈向军，董强，邱玥，刘小妮，邓波，
申请(专利权)人：陈向军，
类型：发明
国别省市：