对用于序列操纵的改进的系统、方法和酶组合物进行的工程化和优化技术方案

本发明专利技术提供了用于操纵序列和/或靶序列的活性的系统、方法、和组合物的工程化和优化。提供了涉及具体地包括Cas直向同源物酶的CRISPR复合物的组分的组合物以及方法。复合物的组分的组合物以及方法。复合物的组分的组合物以及方法。

【技术实现步骤摘要】
对用于序列操纵的改进的系统、方法和酶组合物进行的工程化和优化
[0001]本申请是申请日为2013年12月12日、申请号为201380072821.X、专利技术名称 为“对用于序列操纵的改进的系统、方法和酶组合物进行的工程化和优化”的专利技术 专利申请的分案申请。
[0002]相关应用和引用参考
[0003]本申请要求于2013年6月17日提交的标题为用于序列操纵的系统、方法和酶 组合物的工程化和优化(ENGINEERING AND OPTIMIZATION OF IMPROVEDSYSTEMS,METHODS AND ENZYME COMPOSITIONS FOR SEQUENCEMANIPULATION)的美国临时专利申请61/836,101的优先权。本申请还要求美国 临时专利申请61/758,468；61/769,046；61/802,174；61/806,375；61/814,263； 61/819,803以及61/828,130的优先权，每个的标题为对用于序列操纵的系统、方法 以及组合物进行的工程化和优化，分别提交于2013年1月30日；2013年2月25 日；2013年3月15日；2013年3月28日；2013年4月20日；2013年5月6日 以及2013年5月28日。本申请还要求分别于2012年12月12日和2013年1月2 日提交的标题均为“用于序列操纵的系统、方法和组合物(SYSTEMS METHODSAND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION)”的美国临时专利申 请61/736,527和61/748,427的优先权。还要求分别提交于2013年3月15日和2013 年6月17日的美国临时专利申请61/791,409和61/835,931的优先权。
[0004]参考了美国临时专利申请61/836,127、61/835,936、61/836,080、61/836,123以 及61/835,973，每个提交于2013年6月17日。
[0005]前述申请、以及在其中或在它们的审查程序期间引用的所有文献或(“申请引 用文献”)以及在这些申请引用文献中引用或参考的所有文献、以及在本文中引用 或参考的所有文献(“本文引用的文献”)、在本文中引用的文献中引用或参考的 所有文献，连同针对在本文中提及或通过引用结合在本文中的任何文献中的任何产 品的任何制造商的说明书、说明、产品规格、和产品表，特此通过引用并入本文， 并且可以在本专利技术的实践中采用。更具体地说，所有参考的文献均通过引用并入本 文，其程度如同每个单独的文献被确切地并单独地指明通过引用而并入本文。
专利

[0006]本专利技术总体上涉及用于控制涉及序列靶向的基因表达的系统、方法、和组合物 的工程化和优化，该序列靶向例如涉及规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR) 及其组分的基因组干扰或基因编辑。
[0007]关于联邦资助研究的声明
[0008]本专利技术是在美国国立卫生研究院颁发的NIH先锋奖(Pioneer Award) (1DP1MH100706)的政府支持下完成的。美国政府享有本专利技术的某些权利。
[0009]专利技术背景
[0010]在基因组测序技术和分析方法中的最新进展显著加速了对与范围广泛的生物 功
能和疾病相关联的遗传因子进行编目和映射的能力。精确的基因组靶向技术对于 通过允许个体遗传元件的选择性干扰而使得因果性遗传变异的统性逆向工程成为 可能、以及推进合成生物学、生物技术应用、和医学应用是需要的。虽然基因组编 辑技术，如设计师锌指、转录激活子样效应因子(TALE)、或归巢大范围核酸酶 (homing meganuclease)对于产生靶向的基因组干扰是可得的，但是仍然需要负担 得起的、易于建立的、可扩展的、并且便于靶向真核基因组内的多个位置的新的基 因组工程技术。
[0011]专利技术概述
[0012]CRISPR/Cas或CRISPR
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Cas系统(两个术语在本申请通篇可互换地使用)不 要求产生靶向特异性序列的定制蛋白，而是通过一个短RNA分子识别一个特异性 DNA靶标，可以对单个Cas酶进行程序设计，换句话说可以使用所述短RNA分子 将Cas酶募集到一个特异性DNA靶标。将该CRISPR
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Cas系统添加到基因组测序 技术和分析方法的组库中可以显著使该方法论简化并且提高对与范围广泛的生物 功能和疾病相关联的遗传因子进行编目和映射的能力。为了有效而无有害作用地利 用CRISPR
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Cas系统用于基因组编辑，了解这些基因组工程工具的工程化和优化方 面是至关重要的，这些方面是请求保护的本专利技术的方面。
[0013]因此，对于用于一系列广泛的应用的序列靶向的替代性的稳健的系统和技术存 在着迫切需要。本专利技术的多个方面着手解决这种需要并且提供了相关优点。一种示 例性CRISPR复合物包括与杂交到靶多核苷酸内的一个靶序列的一种指导序列复合 的一种CRISPR酶，其中该CRISPR酶是以下属的一种Cas直向同源物，例如一种 Cas9直向同源物，该属包括但不限于棒状杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺 旋体属、产线菌属、真杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、支原体属、拟杆菌属、类杆 菌属、Flaviivola、黄质菌属、Sphaerochaeta、固氮螺菌属、葡糖醋杆菌属、奈瑟菌 属、罗氏菌属、细小棒菌属(Parvibaculum)、葡萄球菌属、Nitratifractor、支原体 属以及弯曲杆菌属。该指导序列与一种tracr配对序列连接，该tracr配对序列进而 与一种tracr序列杂交。
[0014]在一个方面，本专利技术提供了用于使用CRISPR系统的一个或多个元件的方法。 本专利技术的CRISPR复合物提供了用于修饰靶多核苷酸的有效手段。本专利技术的 CRISPR复合物具有多种多样的实用性，包括修饰(例如，缺失、插入、转位、失 活、激活、阻抑、改变甲基化、转移特定部分)多种细胞类型中的靶多核苷酸。正 因为如此，本专利技术的CRISPR复合物在例如基因或基因组编辑、基因调节、基因治 疗、药物发现、药物筛选、疾病诊断、以及预后中具有广阔的应用谱。在本专利技术的 优选方面，该CRISPR复合物包括一种Cas酶，优选地以下属的一种Cas9直向同 源物，该属包括但不限于棒状杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋体属、产线 菌属、真杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、支原体属、拟杆菌属、类杆菌属、Flaviivola、 黄质菌属、Sphaerochaeta、固氮螺菌属、葡糖醋杆菌属、奈瑟菌属、罗氏菌属、细 小棒菌属(Parvibaculum)、葡萄球菌属、Nitratifractor、支原体属以及弯曲杆菌属。
[0015]本专利技术的方面涉及具有优化功能的CRISPR酶。至于是一种Cas酶的CRISPR 酶，本专利技术的优选实施例涉及在一种CRISPR
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Cas9系统中具有改进的靶特异性的 Cas9直向同源物。这可通过以下途径达到，这些途径包括但不限于设本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种工程化的、非天然存在的CRISPR
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Cas系统，其包括：(a)Cas9蛋白或编码所述Cas9蛋白的多核苷酸；(b)CRISPR
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Cas系统嵌合RNA，其包含能够与真核细胞的核中与原型间隔子邻近基序(PAM)相邻的靶序列杂交并引导CRISPR
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Cas复合物与所述靶序列来序列特异性结合的指导序列，能够与tracr序列杂交的tracr配对序列，和tracr序列。2.一种工程化的、非天然存在的CRISPR
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Cas系统，其包括：(a)Cas9蛋白或编码所述Cas9蛋白的多核苷酸；(b)CRISPR
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Cas系统crRNA，其包含能够与真核细胞的核中与原型间隔子邻近基序(PAM)相邻的靶序列杂交并引导CRISPR
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Cas复合物与所述靶序列来序列特异性结合的指导序列和能够与tracr序列杂交的tracr配对序列；和(c)包含tracr序列的tracrRNA。3.一种工程化的、非天然存在的CRISPR
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Cas载体系统，其包括一个或多个载体，所述载体包含：(a)编码Cas9蛋白的多核苷酸；(b)编码CRISPR
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Cas系统嵌合RNA的多核苷酸，其中所述嵌合RNA包含能够与真核细胞的核中与原型间隔子邻近基序(PAM)相邻的靶序列杂交并引导CRISPR
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Cas复合物与所述靶序列来序列特异性结合的指导序列，能够与tracr序列杂交的tracr配对序列，和tracr序列。4.一种工程化的、非天然存在的CRISPR
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Cas载体系统，其包括一个或多个载体，所述载体包含：(a)编码Cas9蛋白的多核苷酸；(b)编码CRISPR
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Cas系统crRNA的多核苷酸，其中所述crRNA包含能够与真核细胞的核中与原型间隔子邻近基序(PAM)相邻的靶序列杂交并引导CRISPR
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Cas复合物与所述靶序列来序列特异性结合的指导序列，能够与tracr序列杂交的tracr配对序列；和(c)编码tracrRNA的多核苷酸，其中所述tracrRNA包含tracr序列。5.根据权利要求1、2、3或4所述的系统，其中所述Cas9蛋白是选自棒状杆菌属、萨特氏菌属、军团菌属、密螺旋体属、产线菌属、真杆菌属、链球菌属、乳杆菌属、支原体属、拟杆菌属、Flaviivola、黄杆菌属、Sphaerochaeta、固氮螺菌属、葡糖醋杆菌属、奈瑟菌属、罗氏菌属、细小棒菌属、葡萄球菌属、Nitratifractor、支原体属或弯曲杆菌属的属的Cas9直向同源物。6.根据权利要求1、2、3或4所述的系统，其中所述Cas9蛋白选自：沃兹沃思萨特氏菌Cas9、龈沟产线菌Cas9、约氏乳杆菌Cas9、红嘴鸥弯曲杆菌Cas9、白喉棒状杆菌Cas9、食清洁剂细小棒菌Cas9、鸡毒支原体Cas9、金黄色葡萄球菌Cas9、巴黎嗜肺军团菌Cas9、齿垢密螺旋体Cas9、伪中间型葡萄球菌Cas9、或灰色奈瑟菌Cas9。7.根据权利要求1、2、3或4所述的系统，其中所述Cas9蛋白的长度为500
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1000个氨基酸。8.根据权利要求1、2、3或4所述的系统，其中所述tracr序列的长度为至少30个核苷酸。9.根据权利要求1、2、3或4所述的系统，其中所述tracr序列的长度为至少40个核苷酸。10.根据权利要求1、2、3或4所述的系统，其中所述tracr序列的长度为至少50个核苷
酸。11.根据权利要求1、2、3或4所述的系统，其中所述指导序列的长度为15
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30个核苷酸。12.根据权利要求1、2、3或4所述的系统，其中所述Cas9蛋白是能够切割两条DNA链的核酸酶。13.根据权利要求1、2、3或4所述的系统，其中所述Cas9蛋白的至少一个催化结构域被突变，使得所述Cas9蛋白是缺乏切割一条DNA链的能力的切口酶。14.根据权利要求13所述的系统，其中所述Cas9蛋白包含对应于化脓链球菌Cas9的D10A，H840A，N854A或N863A的突变。15.根据权利要求1、2、3或4所述的系统，其中所述Cas9蛋白的至少两个催化结构域被突变，使得所述Cas9蛋白基本上缺乏DNA切割活性。16.根据权利要求15所述的系统，其中所述Cas9蛋白包含对应于化脓链球菌Cas9的D10A的突变和对应于化脓链球菌Cas9的H840A，N854A或N863A的突变。17.根据权利要求1、2、3或4所述的系统，其中所述Cas9蛋白是金黄色葡萄球菌Cas9。18.根据权利要求1、2、3或4所述的系统，其中所述Cas9蛋白与至少一个核定位信号(NLS)连接。19.根据权利要求1、2、3或4所述的系统，其中所述Cas9蛋白与至少两个NLS连接。20.根据权利要求1、2、3或4所述的系统，其中所述Cas9蛋白与至少一个N末端NLS和至少一个C末端NLS连接。21.根据权利要求1、2、3或4所述的系统，其中所述Cas9蛋白与至少一个异源蛋白质结构域连接。22.根据权利要求21所述的系统，其中所述异源蛋白质结构域具有以下活性中的一种或多种：甲基酶活性、脱甲基酶活性、转录激活活性、转录阻抑活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性和核酸结合活性。23.根据权利要求1、2、3或4所述的系统，其中编码所述Cas9蛋白的所述多核苷酸被密码子优化以在哺乳动物细胞或人细胞中表达。24.根据权利要求1或2所述的系统，其中所述系统包括编码所述Cas9蛋白的mRNA。25.根据权利要求3或4所述的系统，其中所述一个或多个载体是病毒载体，任选地其中组分(a)和(b)位于同一载体上。26.根据权利要求25所述的系统，其中所述一个或多个载体是腺相关病毒(AAV)载体。27.根据权利要求1、2、3或4所述的系统在制造用于基因疗法的药物中的用途。28.根据权利要求1、2、3或4所述的系统用于离体或体外修饰真核细胞的用途。29.一种真核细胞，其包含根据权利要求1、2、3或4所述的系统。30.一种非人类生物，其包含权利要求29所述的真核细胞，其中所述非人类生物不是动物或植物品种。31.一种用于产生修饰的真核细胞的离体或体外方法，其包括将工程化的、非天然存在的CRISPR
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Cas系统引入真核细胞，所述系统包括：(a)Cas9蛋白或编码所述Cas9蛋白的多核苷酸；(b)CRISPR
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Cas系统嵌合RNA，其包含能够与真核细胞的核中与原型间隔子邻近基序(PAM)相邻的靶序列杂交并引导CRISPR
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Cas复合物与所述靶序列来序列特异性结合的指导
序列，能够与tracr序列杂交的tracr配对序列，和tracr序列，从而获得修饰的真核细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：F，
申请(专利权)人：麻省理工学院哈佛大学校长及研究员协会，
类型：发明
国别省市：