一种血清9型重组腺相关病毒复合剂的制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种血清9型重组腺相关病毒复合剂的制备方法，首先分别设计合成两端带有EcoR I与Hind III两个酶切位点的目的基因片段，构建含有hsa

【技术实现步骤摘要】
一种血清9型重组腺相关病毒复合剂的制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种血清9型重组腺相关病毒复合剂的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]病理性心肌细胞肥大(pathologicalcardiomyocyteshypertrophy,PCH)是心力衰竭的关键风险因素，其受很多因素的调控，尤其是肾素
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血管紧张素
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醛固酮(RAAS)系统及其主要效应分子血管紧张素II(AngII)。老年个体心脏中AngII上调，RAAS系统激活是引起心脏衰老的关键机制。衰老相关的病理性心肌细胞肥大(SA
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PCH)与RAAS系统活化、心肌纤维化、衰老相关分泌表型(SASP)、心脏功能障碍以及发病率和死亡率增加有关，并且随着衰老成为全球公共卫生日益突出的问题，防治SA
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PCH对治疗多种心血管疾病保护老年健康有着重要的意义。
[0003]腺相关病毒(adeno
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associatedvirus,AAV)，是微小病毒科依赖病毒属，病毒颗粒大小约为20～26nm，经过病毒包装后可以形成携带有外源插入基因的腺相关病毒的病毒颗粒。由于腺相关病毒的安全性能好和表达时效长的优点，目前已成为最有前景的基因治疗工具。腺相关病毒有多种血清型，不同血清型对不同组织的亲和力不同，其中腺相关病毒血清9型对心脏亲和力高，目前已经广泛应用于心脏疾病的靶向基因治疗。
[0004]传统的药物和干预措施仅可部分改善临床症状，探索新的临床治疗方法和策略从而抑制甚至逆转病理性心肌细胞肥大逐渐成为心血管领域研究的重要方向。通过构建血清9型腺相关病毒，通过靶向心脏抑制PCH和SA
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PCH，具有取材方便、易通过大规模培养细胞获得，腺相关病毒不整合到宿主基因组具有安全可靠性、剂量稳定可控，是治疗心血管疾病的一种理想的基因药物。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于解决现有技术的不足，提供一种血清9型重组腺相关病毒复合剂的制备方法。
[0006]技术方案
[0007]专利技术人制备hsa
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miR
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5pDNA序列过表达和hsa
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3p及hsa
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3p串联DNA序列过表达的血清9型重组腺相关病毒复合剂，其效应分子主要为hsa
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5p、hsa
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3p和hsa
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3p，其通过靶向PI3KR1，抑制PI3K信号通路，防治PCH和SA
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PCH，具体方案如下：
[0008]一种血清9型重组腺相关病毒复合剂的制备方法，包括如下步骤：
[0009](1)合成带有EcoRI和HindIII两个酶切位点的hsa
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5p序列，以及带有EcoRI和HindIII两个酶切位点的hsa
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3p和hsa
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miR
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3p串联序列，分别进行PCR扩增，酶切以后利用琼脂糖凝胶电泳将目的片段所在区域切胶回收，得到hsa
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mir
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5p目的片段和hsa
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3p和hsa
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3p串联目的片段；
[0010]所述hsa
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5p序列如SEQIDNO:1所示，hsa
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3p和hsa
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3p串联序列如SEQIDNO:2所示。
[0011](2)将hsa
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mir
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5p目的片段和穿梭质粒pshuttl
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CMV各自用限制性内切酶EcoRI和HindIII双酶切，然后将得到的双酶切反应产物混合，进行DNA连接反应，得到含有hsa
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mir
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5p序列的重组穿梭质粒，对其进行扩增，提纯；
[0012]将hsa
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3p和hsa
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miR
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3p串联目的片段和穿梭质粒pshuttl
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CMV各自用限制性内切酶EcoRI和HindIII双酶切，然后将得到的双酶切反应产物混合，进行DNA连接反应，得到含有hsa
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miR
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3p和hsa
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miR
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3p串联序列的重组穿梭质粒，对其进行扩增，提纯；
[0013](3)将含有hsa
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mir
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5p序列的重组穿梭质粒和含腺相关病毒基因组DNA的pAAV
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RC和pHelper质粒共转染293T细胞，培养后收获细胞，反复冻融后离心，获得病毒上清，即为过表达hsa
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mir
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5p序列的血清9型重组腺相关病毒，提取DNA进行测序鉴定；
[0014]将含有hsa
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miR
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3p和hsa
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miR
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3p串联序列的重组穿梭质粒和含腺相关病毒基因组DNA的pAAV
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RC和pHelper质粒共转染293T细胞，培养后收获细胞，反复冻融后离心，获得病毒上清，即为过表达hsa
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miR
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128
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3p和hsa
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miR
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3p串联序列的血清9型重组腺相关病毒，提取DNA进行测序鉴定；
[0015](4)将过表达hsa
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mir
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种血清9型重组腺相关病毒复合剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)合成带有EcoR I和Hind III两个酶切位点的hsa
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5p序列，以及带有EcoR I和Hind III两个酶切位点的hsa
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3p和hsa
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3p串联序列，分别进行PCR扩增，酶切以后利用琼脂糖凝胶电泳将目的片段所在区域切胶回收，得到hsa
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5p目的片段和hsa
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3p和hsa
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3p串联目的片段；(2)将hsa
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mir
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21
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5p目的片段和穿梭质粒pshuttl
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CMV各自用限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切，然后将得到的双酶切反应产物混合，进行DNA连接反应，得到含有hsa
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mir
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5p序列的重组穿梭质粒，对其进行扩增，提纯；将hsa
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miR
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3p和hsa
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miR
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3p串联目的片段和穿梭质粒pshuttl
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CMV各自用限制性内切酶EcoR I和Hind III双酶切，然后将得到的双酶切反应产物混合，进行DNA连接反应，得到含有hsa
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miR
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3p和hsa
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miR
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3p串联序列的重组穿梭质粒，对其进行扩增，提纯；(3)将含有hsa
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mir
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5p序列的重组穿梭质粒和含腺相关病毒基因组DNA的pAAV
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RC和pHelper质粒共转染293T细胞，培养后收获细胞，反复冻融后离心，获得病毒上清，即为过表达hsa
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mir
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21
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5p序列的血清9型重组腺相关病毒，提取DNA进行测序鉴定；将含有hsa
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3p和hsa
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miR
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3p串联序列的重组穿梭质粒和含腺相关病毒基因组DNA的pAAV
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RC和pHelper质粒共转染293T细胞，培养后收获细胞，反复冻融后离心，获得病毒上清，即为过表达hsa
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3p和hsa
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3p串联序列的血清9型重组腺相关病毒，提取DNA进行测序鉴定；(4)将过表达hsa
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mir
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【专利技术属性】
技术研发人员：靳建亮，苗登顺，王嵘，周佳雯，陈海云，谢春凤，朱剑云，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：