CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在制备治疗遗传性感音神经性聋的药物中的应用技术方案

本发明专利技术公开了一种CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在制备治疗遗传性感音神经性聋的药物中的应用，所述的基因编辑系统包括特异性靶向Myo6

【技术实现步骤摘要】
CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在制备治疗遗传性感音神经性聋的药物中的应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域、医药领域，具体涉及一种CRISPR/Cas9基因编辑系统及其在制备治疗遗传性感音神经性聋的药物中的应用。

技术介绍

[0002]肌球蛋白VI(Myosin VI，MYO VI)是一种非常规肌球蛋白，在内耳的内外毛细胞均有表达，特别是纤毛的表皮板，因此认为该蛋白对于纤毛在表皮板的锚定发挥重要作用。MYO6基因的致病变异导致常染色体显性遗传非综合征性听力丧失或常染色体隐性遗传性非综合征性听力丧失。对日本听力损失患者进行的大规模遗传分析发现，2.4％的常染色体显性遗传感音神经性耳聋病例是由MYO6突变引起的。肌球蛋白VI p.C442Y突变在人类引起在儿童时期开始发生进行性听力损失，到5岁时表现出严重的感音神经性聋。虽然MYO6突变在遗传性耳聋中发挥重要作用，但目前尚缺乏有效的治疗和预防方法。
[0003]腺相关病毒(AAV)介导的基因过表达治疗在隐性小鼠耳聋模型的多项临床前试验已报道成功地治疗了听力损伤。然而，这种策略的缺点是其有效期短，非靶细胞的过量蛋白表达造成未知风险，且缺乏控制基因表达的元件，这种疗法不适合于像肌球蛋白VI p.C442Y那样的半显性遗传突变。
[0004]因此，我们亟需寻找一种有效针对Myo6
C442Y
突变基因导致的半显性遗传感音神经性聋的治疗方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对缺乏治疗Myo6
C442Y
突变基因导致的耳聋的问题，目的在于提供一种CRISPR/Cas9基因编辑系统，用以特异性靶向并敲除Myo6
C442Y
突变基因，保留野生型链使Myo6
WT
基因发挥正常功能，从而治疗由Myo6
C442Y
突变基因导致的半显性遗传感音神经性聋，可制备治疗遗传性感音神经性聋的药物。
[0006]基于上述，本专利技术首先提供一种CRISPR/Cas9基因编辑系统，所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统特异性靶向并敲除Myo6
C442Y
突变基因，该基因编辑系统包含靶基因为Myo6
C442Y
突变基因的gRNA。
[0007]优选地，所述的gRNA的靶向序列如SEQ ID NO：2所示。
[0008]优选地，所述的Cas9为SaCas9
‑
KKH。
[0009]优选地，所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统通过腺相关病毒载体递送。
[0010]进一步地，所述的腺相关病毒为AAV
‑
PHP.eB病毒。
[0011]本专利技术还提供了所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统在制备治疗遗传性感音神经性聋的药物中的应用；所述的遗传性感音神经性聋为Myo6
C442Y
突变基因导致的半显性遗传感音神经性聋。
[0012]所述的药物特异性靶向并敲除Myo6
C442Y
突变基因，保留野生型链使Myo6
WT
基因发
挥正常功能。
[0013]本专利技术还提供了一种治疗遗传性感音神经性聋的药物组合物，所述的药物组合物包括：前面任一所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，以及药学上和生理学上可接受的载体。
[0014]相对于现有技术，本专利技术的有益效果是：
[0015](1)本专利技术基于CRISPR/Cas9技术，提供了AAV
‑
SaCas9
‑
KKH
‑
Myo6
‑
g2系统，且通过Myo6
WT/C442Y
小鼠模型实验，评价其对小鼠听力损失的影响，结果发现AAV
‑
SaCas9
‑
KKH
‑
Myo6
‑
g2系统能特异性地敲除Myo6
WT/C442Y
小鼠中的Myo6
C442Y
突变等位基因，且在Myo6
WT/C442Y
小鼠中注射AAV
‑
SaCas9
‑
KKH
‑
Myo6
‑
g2治疗系统后长达5个月的时间内，可观察到听觉功能的恢复，同时，还观察到ABR I波潜伏期变短、细胞存活率提高、纤毛形态变规则，直观地验证了AAV
‑
SaCas9
‑
KKH
‑
Myo6
‑
g2治疗系统对Myo6
C442Y
突变基因导致的半显性遗传感音神经性聋的治疗作用。
[0016](2)本专利技术提供的AAV
‑
SaCas9
‑
KKH
‑
Myo6
‑
g2系统特异性敲除Myo6
WT/C442Y
小鼠中的Myo6
C442Y
突变等位基因，保留Myo6
WT
等位基因使其发挥功能，首次验证敲除突变链，保留野生型链，可进行Myo6
C442Y
半显性耳聋治疗，为利用体内基因组编辑技术治疗各种半显性遗传形式的听力损失和其他半显性遗传疾病提供了进一步的证据和支持。
附图说明
[0017]图1为破坏Myo6
C442Y
突变等位基因的基因组编辑策略；其中：
[0018]A为SaCas9
‑
KKH sgRNA的设计；
[0019]B为Myo6
C442Y/C442Y mESCs体外研究示意图；
[0020]C
‑
D为Myo6
WT/WT
、Myo6
C442/C442Y
和Myo6
WT/C442Y mESCs中Myo6
‑
g1和Myo6
‑
g2的插入/缺失百分比；
[0021]E为SaCas9
‑
KKH
‑
Myo6
‑
g2转染Myo6
C442Y/C442Y mESCs后引起整码和移码突变的比例；
[0022]F
‑
G为SaCas9
‑
KKH
‑
Myo6
‑
g2转染Myo6
C442Y/C442Y mESCs后引起的插入缺失图谱。
[0023]图2为使用AAV
‑
SaCas9
‑
KKH
‑
Myo6
‑
g2系统进行体内基因组编辑的研究及结果；其中：
[0024]A为AAV载体示意图和体内研究的实验流程图；
[0025]B
‑
C为P14时治疗组、未治疗组感觉上皮细胞中的插入/缺失百分比；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统特异性靶向并敲除Myo6
C442Y
突变基因，该基因编辑系统包含靶基因为Myo6
C442Y
突变基因的gRNA。2.如权利要求1所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述的gRNA的靶向序列如SEQ ID NO：2所示。3.如权利要求2所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述的Cas9为SaCas9
‑
KKH。4.如权利要求3所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统，其特征在于，所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统通过腺相关病毒载体递送。5.如权利要求4所述的CRISPR/Cas9基因编辑系统...

【专利技术属性】
技术研发人员：舒易来，李华伟，薛媛媛，王大奇，
申请(专利权)人：复旦大学附属眼耳鼻喉科医院，
类型：发明
国别省市：