封闭端DNA（CEDNA）产生中对REP蛋白活性的调节制造技术

本文提供了用于产生DNA载体的方法，所述方法包括在至少具有DNA结合和DNA切口产生功能的仅单个种类的Rep蛋白存在的情况下在有效条件下将携带所述载体多核苷酸的细胞群温育足以诱导所述DNA在所述细胞内产生的时间，所述载体多核苷酸对操作性地定位于第一AAV反向末端重复DNA多核苷酸序列与第二AAV反向末端重复DNA多核苷酸序列(ITR)之间的异源核酸进行编码，其中所述ITR中的至少一个ITR具有对应于AAV野生型ITR的核苷酸序列；以及从所述细胞中采集和分离具有所述ITR的所得DNA。中采集和分离具有所述ITR的所得DNA。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】封闭端DNA(CEDNA)产生中对REP蛋白活性的调节
[0001]相关申请
[0002]本申请要求于2019年2月15日提交的美国临时申请第62/806,076号的优先权，所述美国临时申请的内容通过引用以其整体并入本文。
[0003]序列表
[0004]本申请含有序列表，所述序列表在此通过引用以其整体并入。所述ASCII副本创建于2020年2月13日，被命名为131698
‑
05420_SL.txt并且大小为388,896字节。


[0005]本专利技术涉及基因疗法领域，包含将外源DNA序列递送到目标细胞、组织、器官或生物体。

技术介绍

[0006]基因疗法旨在改善患有因基因表达谱畸变引起的基因突变或获得性疾病的患者的临床结果。基因疗法包含治疗或预防因可能导致病症、疾病、恶性病等的缺陷基因或异常调控或表达，例如表达不足或过表达所引起的医学病状。例如，可以通过向患者递送矫正性遗传物质，使得所述遗传物质在患者体内发生治疗性表达来治疗、预防或改善由缺陷基因引起的疾病或病症。基因疗法的基础是供应具有活性基因产物(有时被称为转基因)的转录盒，所述活性基因产物例如可以产生正功能获得性作用、负功能损失性作用或其它结果，如溶瘤作用。人单基因病症可以通过将正常基因递送给目标细胞并表达来治疗。矫正基因在患者目标细胞中的递送和表达可以通过多种方法进行，包含使用工程化病毒和病毒基因递送载体。在许多可用的病毒来源载体(例如，重组逆转录病毒、重组慢病毒、重组腺病毒等)当中，重组腺相关病毒(recombinant adeno
‑
associated virus；rAAV)作为基因疗法中的多用途载体越来越受到欢迎。
[0007]腺相关病毒(AAV)属于细小病毒科，并且更具体地说，组成依赖病毒属。AAV基因组由线性单链DNA分子构成，所述分子含有大约4.7千碱基(kb)并且由编码非结构性Rep(复制)和结构性Cap(衣壳)蛋白的两个主要开放阅读框(open reading frame；ORF)组成。在cap基因内鉴定出第二个ORF，其编码装配激活蛋白(assembly
‑
activating protein；AAP)。侧接AAV编码区的DNA是两个顺式作用的反向末端重复(ITR)序列，长度大约为145个核苷酸，具有间断的回文序列，所述回文序列可以折叠成能量稳定的发夹结构，起到DNA复制引物的功能。除了它们在DNA复制中的作用之外，ITR序列还展示参与病毒DNA整合到细胞基因组中、从宿主基因组或质粒中拯救，以及将病毒核酸衣壳化为成熟的病毒粒子(Muzyczka,(1992)《微生物学与免疫学的当前课题(Curr.Top.Micro.Immunol.)》158:97
‑
129))。
[0008]源自于AAV的载体(即，重组AAV(rAVV)或AAV载体)对于递送遗传物质具有吸引力，因为(i)它们能够感染(转导)多种多样的非分裂和分裂细胞类型，包含肌细胞和神经元；(ii)它们缺乏病毒结构基因，从而减弱了宿主细胞对病毒感染的应答，例如干扰素介导的应答；(iii)野生型病毒被认为在人中是非致病性的；(iv)与能够整合到宿主细胞基因组中
的野生型AAV相比，复制缺陷型AAV载体缺乏rep基因，并且通常作为附加体存留，从而限制了插入诱变或基因毒性的风险；以及(v)与其它载体系统相比，AAV载体通常被认为是相对较弱的免疫原，因此不会触专利技术显的免疫应答(参见ii)，从而获得了载体DNA的持久性以及治疗性转基因的潜在长期表达。AAV载体还可以高滴度地产生和调配，并通过动脉内、静脉内或腹膜内注射来递送，从而在啮齿动物(Goyenvalle等人,2004；Fougerousse等人,2007；Koppanati等人,2010；Wang等人,2009)和犬中允许通过单次注射对重要肌肉区域进行载体分布和基因转移。在一项治疗脊椎型肌营养不良症1型的临床研究中，以靶向大脑为目的全身性递送AAV载体，产生明显的临床改善。
[0009]然而，使用AAV颗粒作为基因递送载体存在几个主要缺陷。与rAAV相关的一个主要缺点是其病毒包装容量有限，为约4.5kb的异源DNA(Dong等人,1996；Athanasopoulos等人,2004；Lai等人,2010)。因此，AAV载体的使用仅限于小于150kDa的蛋白质编码能力。第二个缺点是，由于群中野生型AAV感染盛行，所以必须筛查rAAV基因疗法候选者中从患者消除所述载体的中和抗体的存在。第三个缺点与衣壳免疫原性有关，所述免疫原性阻止了对未从初始治疗中排除的患者进行再施用。患者的免疫系统可以对有效充当“强化”注射的所述载体作出应答，以刺激免疫系统产生高滴度的抗AAV抗体，从而杜绝了进一步治疗。最近的一些报告指出在高剂量情况下对免疫原性的顾虑。另一个值得注意的缺点是，鉴于在异源基因表达之前必须将单链AAV DNA转化为双链DNA，所以AAV介导的基因表达的启动相对较慢。尽管已经尝试通过构建双链DNA载体来规避这个问题，但这个策略进一步限制了可以整合到AAV载体中的转基因表达盒的大小(McCarty,2008；Varenika等人,2009；Foust等人,2009)。
[0010]另外，通过引入一种或多种含有AAV基因组、rep基因和cap基因的质粒，产生具有衣壳的常规AAV病毒粒子(Grimm等人,1998)。在以反式引入这些辅助质粒后，就从宿主基因组“拯救”(即释放并随后扩增)了AAV基因组，并进一步衣壳化(病毒衣壳)以产生生物活性AAV载体。然而，发现此类衣壳化AAV病毒载体转导某些细胞和组织类型的效率低。衣壳还诱导免疫应答。
[0011]因此，由于对患者的单次施用(因患者的免疫应答之故)、因相关AAV衣壳的病毒包装容量极低(约4.5kb)而使得适合于在AAV载体中递送的转基因遗传物质的范围有限、以及AAV介导的基因表达缓慢，腺相关病毒(AAV)载体在基因疗法中的使用受到限制。因患者之间的变异性无法通过在同基因小鼠模型或其它模型物种中的剂量反应来预测，从而进一步阻碍了rAAV临床基因疗法的应用。
[0012]重组无衣壳AAV载体可以作为分离的线性核酸分子获得，所述线性核酸分子包括侧接有两个野生型AAV反向末端重复序列(ITR)的可表达的转基因和启动子区，所述反向末端重复序列包含Rep结合位点和末端解链位点(TRS)。这些重组AAV载体缺乏AAV衣壳蛋白编码序列，并且可以是一端或两端通过两个野生型ITR回文序列共价连接的单链、双链或双链体(例如WO2012/123430、美国专利9,598,703)。它们避免了AAV介导的基因疗法的许多问题，因为转基因容量高得多，转基因表达起动快，并且患者的免疫系统将DNA分子识别为需要清除的病毒。然而，转基因的恒定表达并非在所有情况下都是理想的，并且AAV规范野生型ITR可能未针对ceDNA功能进行优化。因此，对于可控重组DNA载体以及改善的产生和/或表达性质仍然存在重要的未满足需本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种从载体多核苷酸获得的DNA载体，其中所述载体多核苷酸对操作性地定位于第一反向末端重复DNA多核苷酸序列(ITR)与第二ITR之间的异源核酸进行编码，其中所述第一ITR和所述第二ITR中的至少一个ITR包括对应于AAV Rep结合序列的核苷酸序列，以在单个种类的Rep蛋白存在的情况下诱导所述DNA载体在细胞中复制，所述DNA载体可通过包括以下步骤的方法获得：a.在至少具有DNA结合和DNA切口产生功能的单个种类的Rep蛋白存在的情况下在有效条件下将携带所述载体多核苷酸的细胞群温育足以诱导所述DNA载体在所述细胞内产生的时间，所述细胞群缺乏病毒衣壳编码序列，其中所述细胞不包括病毒衣壳编码序列，并且其中不存在其它种类的Rep蛋白；以及b.从所述细胞中采集和分离所得DNA载体。2.根据权利要求1所述的DNA载体，其中所述细胞不与对第二Rep蛋白进行编码的核苷酸序列接触。3.根据权利要求1所述的DNA载体，其中所述单个Rep蛋白进一步具有解旋酶、连接酶和ATP酶功能。4.根据权利要求1所述的DNA载体，其中所述Rep蛋白是AAV Rep蛋白。5.根据权利要求4所述的DNA载体，其中所述Rep蛋白选自以下中的任何一种：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12 Rep蛋白。6.根据权利要求4所述的DNA载体，其中所述Rep蛋白是AAV2 Rep 68蛋白。7.根据权利要求4所述的DNA载体，其中所述Rep蛋白是AAV2 Rep 78蛋白。8.根据权利要求7所述的DNA载体，其中所述Rep 78蛋白由不具有用于Rep 52的功能性翻译起始密码子的突变Rep78核苷酸序列编码。9.根据权利要求8所述的DNA载体，其中所述突变Rep 78核苷酸序列对包括SEQ ID NO:530的氨基酸位置225处的突变的突变Rep 78蛋白进行编码。10.根据权利要求9所述的DNA载体，其中SEQ ID NO:530的氨基酸位置225突变为甘氨酸(Gly)或苏氨酸(Thr)。11.根据权利要求8所述的DNA载体，其中所述突变Rep 78核苷酸序列包括SEQ ID NO:530的序列或包括与SEQ ID NO:530具有至少95％序列同一性的序列并且至少具有DNA结合和DNA切口产生功能，并且不表达第二Rep蛋白。12.根据权利要求1所述的DNA载体，其中所述ITR是细小病毒ITR。13.根据权利要求12所述的DNA载体，其中所述细小病毒是依赖病毒。14.根据权利要求1所述的DNA载体，其中所述DNA载体是具有共价封闭端的非病毒无衣壳双链DNA载体(ceDNA载体)。15.根据权利要求14所述的DNA载体，其中可以通过以下来确认从所述细胞分离的所述ceDNA载体的存在：用在所述DNA载体上具有单个识别位点的限制酶来消化从所述细胞分离的DNA，并且在非变性凝胶上分析消化的DNA材料，以与线性和非连续DNA相比确认线性和连续DNA的特征带的存在。16.一种从载体多核苷酸获得的DNA载体，其中所述载体多核苷酸对操作性地定位于两个不同反向末端重复序列(ITR)之间的异源核酸进行编码，其中所述ITR中的至少一个ITR是包括功能性末端解链位点和Rep结合位点的功能性ITR；单个种类的Rep蛋白的存在诱导
所述载体多核苷酸的复制和所述DNA载体在细胞中的产生，所述DNA载体可通过包括以下步骤的方法获得：a.在至少具有DNA结合和DNA切口产生功能的单个种类的Rep蛋白存在的情况下在有效条件下将携带所述载体多核苷酸的细胞群温育足以诱导所述DNA载体在所述细胞内产生的时间，所述细胞群缺乏病毒衣壳编码序列，其中所述细胞不包括对所述细胞内的Rep52或Rep40进行编码的任何核酸，其中所述细胞中不存在其它种类的Rep；以及b.从所述细胞中采集和分离所述DNA载体。17.一种用于生成DNA载体的多核苷酸，所述DNA载体包括核苷酸序列，所述核苷酸序列对至少具有DNA结合和DNA切口产生功能的单个种类的Rep蛋白氨基酸序列进行编码、与至少一个表达控制序列操作性地连接。18.根据权利要求17所述的多核苷酸，其中所述Rep蛋白具有解旋酶、连接酶和ATP酶功能。19.根据权利要求17所述的多核苷酸，其中所述Rep蛋白是AAV Rep蛋白。20.根据权利要求19所述的多核苷酸，其中所述AAV Rep蛋白选自以下中的任何一种：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12 Rep蛋白。21.根据权利要求19所述的多核苷酸，其中所述AAV Rep蛋白是AAV2 Rep蛋白。22.根据权利要求19所述的多核苷酸，其中所述AAV Rep蛋白是AAV2 Rep 78蛋白。23.根据权利要求22所述的多核苷酸，其中所述Rep 78蛋白由不具有用于Rep 52的功能性起始密码子的突变Rep78核苷酸序列编码。24.根据权利要求23所述的多核苷酸，其中所述突变Rep 78核苷酸序列对包括SEQ ID NO:530的氨基酸位置225处的突变的突变Rep78蛋白进行编码。25.根据权利要求24所述的多核苷酸，其中SEQ ID NO:530的氨基酸225突变为甘氨酸(Gly)或苏氨酸(Thr)。26.根据权利要求23所述的多核苷酸，其中所述突变Rep 78核苷酸序列包括SEQ ID NO:530的序列或包括与SEQ ID NO:530具有至少95％序列同一性的序列并且至少具有DNA结合和DNA切口产生功能，并且不表达第二Rep蛋白。27.根据权利要求17所述的多核苷酸，其中所述至少一个表达控制序列对IE启动子、ΔIE启动子或CMV启动子进行编码。28.根据权利要求17所述的多核苷酸，其中所述DNA载体是具有共价封闭端的非病毒无衣壳双链DNA载体(ceDNA载体)。29.根据权利要求28所述的多核苷酸，其中可以通过以下来确认从所述细胞分离的所述ceDNA载体的存在：用在所述DNA载体上具有单个识别位点的限制酶来消化从所述细胞分离的DNA，并且在非变性凝胶上分析消化的DNA材料，以与线性和非连续DNA相比确认线性和连续DNA的特征带的存在。30.一种产生DNA载体的方法，所述方法包括使细胞与以下接触：(1)核苷酸序列，所述核苷酸序列对至少具有DNA结合和DNA切口产生功能的单个种类的AAV Rep蛋白(Rep78和/或Rep68)进行编码、与至少一个表达控制序列连接，其中所述细胞不表达任何其它种类的Rep蛋白并且不与任何其它种类的Rep蛋白接触；
(2)双链DNA构建体，所述双链DNA构建体包括：表达盒；在所述表达盒上游(5'端)的第一ITR；以及在所述表达盒下游(3'端)的第二ITR；以及(3)采集所述DNA载体。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述Rep蛋白是AAV Rep蛋白。32.根据权利要求31所述的方法，其中所述AAV Rep蛋白选自以下中的任何一种：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12 Rep蛋白。33.根据权利要求31所述的方法，其中所述AAV Rep蛋白是AAV2 Rep 68蛋白。34.根据权利要求31所述的方法，其中所述AAV Rep蛋白是AAV2 Rep 78蛋白。35.根据权利要求34所述的方法，其中Rep 78蛋白由不具有用于Rep 52的功能性起始密码子的突变Rep78核苷酸序列编码。36.根据权利要求35所述的方法，其中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：R，
申请(专利权)人：世代生物公司，
类型：发明
国别省市：